Docente

Irene Mavelli irene.mavelli@uniud.it

Crediti

7 CFU

Finalità

L’obiettivo del Corso è di far acquisire allo studente le nozioni fondamentali della BIOCHIMICA GENERALE STRUTTURALE. Parti fondamentali del corso sono struttura e funzione delle proteine; correlazione struttura-funzione e interazioni proteina-ligando; proteine, lipidi e carboidrati di membrana; membrane e trasporto. Tali nozioni sono necessarie per la comprensione delle innumerevoli applicazioni biotecnologiche delle proteine e dei meccanismi molecolari alla base dei processi vitali della cellula.
Il Corso è teorico–pratico ed ha anche lo scopo di far acquisire allo studente le abilità di base indispensabili per affrontare un esperimento di Biochimica e alcune nozioni e competenze fondamentali delle METODOLOGIE BIOCHIMICHE, con particolare riguardo alle strategie per l’isolamento e la purificazione di proteine e alle tecniche analitiche per il monitoraggio della purificazione. Vengono fornite le basi teoriche di metodologie e tecniche di uso corrente, che sono anche oggetto di esercitazioni di laboratorio, nonché informazioni relative a possibili applicazioni e sviluppi avanzati di queste.
Il corso è finalizzato pertanto all’acquisizione sia di conoscenze teoriche sia di competenze pratiche, dando modo allo studente di applicare in laboratorio alcune nozioni acquisite durante le lezioni. Ogni esperienza di laboratorio è preceduta da un’introduzione che illustra sia il problema sperimentale da affrontare e l'obiettivo da perseguire, sia gli strumenti e i reagenti da usare. Ogni esperienza inoltre è seguita dalla discussione dei dati ottenuti.

Programma dettagliato
 

Parte Teorica (4 cfu, 40 ore) “Biochimica strutturale”

AMINOACIDI E PEPTIDI
Struttura e proprietà degli alfa-aminoacidi proteici. Proprietà delle catene laterali degli alfa-aminoacidi. Aminoacidi non proteici. Determinazione del punto isoelettrico di un aminoacido. Analisi cromatografica degli aminoacidi. Il legame peptidico e la sua struttura. I principali oligopeptidi e peptidi e loro funzione biochimica.

PROTEINE: STRUTTURA/FUNZIONE. INTERAZIONE PROTEINA-LIGANDO. SPECIFICITÀ E RICONOSCIMENTO MOLECOLARE.
1- Strutture delle proteine
Livelli strutturali: primario, secondario, terziario e quaternario. Conformazione delle proteine. Strategie per la determinazione della struttura primaria di una proteina. Struttura secondaria in alfa-elica. Struttura secondaria a foglietto beta. Ripiegamenti della catena polipeptidica (beta turns) e Struttura terziaria. Strategie per l’analisi della struttura terziaria. Strutture supersecondarie e domini. Varietà di strutture nelle proteine. Processo di strutturazione proteica. Strutture quaternarie. Proteine globulari e proteine fibrillari. Proteine fibrose costituenti strutturali di cellule e tessuti. Proteine del tessuto connettivo.
2-Proteine Coniugate
Le diverse classi di proteine coniugate. Gruppi prostetici e cofattori. Metallo-proteine.
3-Interazione proteina-ligando.
Aspetti strutturali alla base di specificità e riconoscimento molecolare. Analisi cinetica.
4-Emoproteine, emoglobina e trasporto dell'ossigeno
Struttura molecolare di emoglobina Hb e mioglobina Mb. Gruppo eme e l’interazione con la parte proteica. Proprietà del legame ossigeno-eme e del legame CO-eme. Curve di dissociazione ossigeno-Hb e ossigeno-Mb. La Hb come esempio di proteina allosterica. Concetto di cooperatività e allosterismo. Effettori allosterici. Stati conformazionali diversi di Hb. Effetto Bohr. effetto dei protoni e della CO2. Effetto del 2,3-DPG. Significato fisiologico del legame di 2,3-DPG. Emoglobina fetale. Le emoglobinopatie:esempi di malattie molecolari.
4-Glicoproteine. Proprietà strutturali dei glicidi complessi. Glicoproteine N-glicosilate e O-glicosilate. Proteine glicate. Proteine della matrice extracellulare: proteoglicani e glucosoaminoglicani.

LIPIDI, MEMBRANE E TRASPORTO: PROTEINE DI MEMBRANA E LORO INTERAZIONE CON IL DOPPIO STRATO LIPIDICO
1-Lipidi,
Acidi grassi: nomenclatura e caratteristiche strutturali degli acidi grassi saturi ed insaturi più rappresentati nei sistemi biologici. Triacilgliceroli. Glicerofosfolipidi. Sfingofosfolipidi. Cere. Terpeni. Steroidi. Modello a mosaico fluido delle membrane biologiche. Lipidi di membrana: aspetti qualitativi, quantitativi e funzionali. Microdomini lipidici.
2-Proteine di membrana e trasposto
Struttura delle proteine di membrana. Classificazione in base alla loro interazione con il doppio strato lipidico. Gli approcci per lo studio della topologia delle proteine di membrana. Le àncore lipidiche. Diffusione semplice e trasporto mediato da proteine. Cinetica di trasporto. Processi di trasporto sostenuti dall’ATP. Canali ionici e Pompe di membrana.

MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DELLE PROTEINE
Modificazioni ossidative e modificazioni covalenti. Rilevanza strutturale e ruolo biologico.

Parte Metodologico-sperimentale con laboratorio (3 cfu, 45 ore) “Isolamento e purificazione di proteine”

1-ASPETTI METODOLOGICI GENERALI
Applicazioni di interesse biotecnologico.
Definizione di strategie per la purificazione di una proteina e conoscenze richieste relative alle proprietà della proteina di interesse.
Tecniche attualmente in uso per la purificazione di proteine: tecniche separative e tecniche analitiche.
Procedure di isolamento di proteine basate sulla solubilità differenziale: salting out, precipitazione con ioni di metalli bivalenti e con solventi organici, precipitazione isoelettrica.
Procedure di purificazione basate su separazioni cromatografiche selettive in logica sequenza.
Criteri di scelta della strategia di purificazione in relazione agli obiettivi della purificazione: qualità e quantità del prodotto da ottenere. costi della procedura da adottare.
Fasi della purificazione. a) Scelta del materiale di partenza; b) isolamento di frazioni subcellulari, centrifugazione differenziale e in gradiente di densità; c) estrazione, solubilizzazione e isolamento di proteine: procedure per proteine intracellulari solubili, per proteine intracellulari di membrana, per proteine extracellulari, per proteine ingegnerizzate (sovraespresse in organismi manipolati geneticamente con una sequenza peptidica che promuove l'esportazione dalle cellule); d) purificazione della proteina di interesse dalla frazione arricchita; e) concentrazione del campione, filtrazione, ultrafiltrazione e dialisi; f) conservazione della proteina purificata: congelamento e liofilizzazione.

2-TECNICHE CROMATOGRAFICHE
Principi generali e tipi di cromatografia. Cromatografia liquida per esclusione molecolare, a scambio ionico, per adsorbimento e interazione idrofobica, di partizione in fase normale ed in fase inversa, per affinità.
Cromatografia su strato sottile.
Cromatografia su colonna. Fasi, ottimizzazione della separazione cromatografica, interpretazione dei cromatogrammi, analisi quantitativa: standardizzazione esterna e standardizzazione interna.
Cromatografia liquida ad alta risoluzione. HPLC e FPLC, tipi di rivelatori, applicazioni avanzate: micro e nanoHPLC.

3-TECNICHE ELETTROFORETICHE
Principi generali. Tipi di elettroforesi attualmente in uso per separazione e analisi di miscele complesse di proteine: elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni native e in condizioni denaturanti (SDS-PAGE). Metodi di rilevazione e analisi quantitativa. Tecniche elettroforetiche avanzate: Isoelettrofocalizzazione. Elettroforesi bidimensionale. Elettroforesi capillare e ad alta risoluzione.

4-MONITORAGGIO DEL PROCESSO DI PURIFICAZIONE
Saggi per la determinazione del contenuto totale di proteina nelle frazioni . Saggi enzimatici, saggi immunologici. Fattore di purificazione e resa.

5-CRITERI DI OMOGENEITÀ E DI PUREZZA
Tecniche di base: Elettroforesi. Cenni su ultracentrifugazione analitica

6-DETERMINAZIONE DELLA MASSA MOLECOLARE E DELLA STRUTTURA QUATERNARIA DI PROTEINE
Tecniche di base: SDS-PAGE e Cromatografia liquida per esclusione molecolare. Cenni su tecniche sofisticate: ultracentrifugazione analitica, spettrometria di massa.

Esperienze di laboratorio
1. Determinazione della concentrazione proteica di soluzioni di proteine pure o di miscele complesse di proteine.
Derivatizzazione dei campioni per la formazione del cromogeno, applicazione della legge di Lambert-Beer, standardizzazione del saggio (costruzione del grafico di taratura utilizzando albumina come proteina standard e verifica dell’intervallo di linearità), determinazione della concentrazione incognita di proteine, valutazione dell’errore analitico e della precisione del saggio. Confronto tra metodi diversi in termini di sensibilità e accuratezza.
2. Isolamento del settore idrosolubile F1 del complesso F0F1ATPsintasi da mitocondri isolati da cuore bovino, utilizzando tecniche basate sulla solubilità differenziale di tale settore rispetto ad altre proteine mitocondriali
3. Separazione della proteina inibitrice (IF1) legata ad ATPsintasi, effettuando precipitazione in etanolo in presenza di ammonio solfato seguita da dialisi
4. Purificazione mediante Cromatografia liquida per gel-filtrazione del complesso proteico che costituisce il settore F1, dalla frazione arricchita ottenuta nel corso della prima esperienza
5. Monitoraggio della purificazione mediante determinazione con il metodo dell’acido bicinconinico (BCA) della quantità di F1 eluita dalla colonna cromatografia. Calcolo della resa
6. Allestimento e sviluppo di una Cromatografia liquida per gel-filtrazione per la separazione di proteine da composti a basso peso molecolare
7. Purificazione del lisozima mediante Cromatografia a scambio ionico su colonna
8. Elettroforesi di proteine su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti (SDS-PAGE) per la determinazione della massa molecolare e della struttura quaternaria delle proteine. Colorazione e conservazione del gel
 

Propedeuticità

Chimica Generale, Chimica Organica, Fisica

Bibliografia

Principi di Biochimica di Lehninger. D.L. Nelson & M.M. Cox (ed. Zanichelli)
Fondamenti di Biochimica. D Voet, J Voet, C Pratt - edizione Zanichelli.
Biochimica. J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer (ed. Zanichelli).
Metodologie di Base per la Biochimica e la Biotecnologia, Ninfa-Ballou (ed. Zanichelli)
Le bioconoscenze e le biotecnologie in Laboratorio Wilson-Walker - nuova edizione (ed. Cortina)

I testi indicati sono consigliati come possibili alternative, ma sono disponibili in commercio numerosi altri testi di Biochimica aggiornati e validi.
Per la parte di Laboratorio agli studenti vengono anche forniti i protocolli degli esperimenti, alcuni manuali per l’uso di strumenti e dispense di approfondimento relative a tecniche applicate in laboratorio.

Modalita’ d’esame

L’esame consiste in una prova scritta unica, finalizzata a verificare le conoscenze teoriche e le competenze pratiche-sperimentali acquisite. La prova consiste in domande a risposta aperta breve e/o a scelta multipla, nonché nella soluzione di esercizi e problemi in relazione alla parte sperimentale affrontata durante le esercitazioni di laboratorio.
Contribuiscono alla valutazione complessiva anche le relazioni scritte di ogni esperienza di laboratorio che gli studenti durante il corso sono tenuti a redigere, rispondendo ad eventuali quesiti formulati dal docente.

Modalità di contatto con i docenti

I docenti sono disponibili a ricevere gli studenti in qualsiasi giorno (Dipartimento di Scienze Mediche e Biologiche, Piazzale Kolbe 4, Udine). Per prendere appuntamento telefonare al 0432-494350 (Prof.ssa Irene Mavelli) o inviare e-mail a irene.mavelli@uniud.it o a stefania.contessi@uniud.it. La posta elettronica può essere usata anche per rivolgere direttamente domande o richieste di spiegazione ai docenti.