INFORMAZIONI SU

Diagnostica Molecolare (corso integrato)

Programma dell'insegnamento di Diagnostica Molecolare - Corso di laurea in Biotecnologie (2012/13)

Docenti

Giuliana Stel giuliana.stel@uniud.itSabina Cauci sabina.cauci@uniud.itPaolo Antonio Beltrami antonio.beltrami@uniud.it

Crediti

6 CFU

Finalità

Obiettivo del corso è quello di fornire allo studente la conoscenza dell’evoluzione tecnologica negli esami diagnostici associati a diverse condizioni patologiche con particolare riguardo all’applicazione della biologia molecolare all’anatomia patologica, la conoscenza delle modalità di esecuzione e dei principi di analisi dei principali parametri biochimici associati alla valutazione di condizioni patologiche degli organi principali, la conoscenza delle modalità di evoluzione tecnologica di alcuni importanti saggi diagnostici biochimico-clinici, nonché delle modalità di valutazione della qualità analitica.
Alla fine del corso lo studente dovrà aver maturato la capacità di comprendere le attuali strategie diagnostiche, di conoscerne i limiti, di allestire controlli di qualità e di progettare nuove strategie basate sulle biotecnologie.

 

Programma

Modulo I
(CFU 2, Giuliana Stel)

OBIETTIVO SPECIFICO
Obiettivo del corso è quello di fornire allo studente la conoscenza della modalità di esecuzione e dei principi di analisi dei principali parametri biochimici associati alla valutazione e/o della condizioni patologiche degli organi principali.

PROGRAMMA DEL CORSO
Uso corretto delle analisi di laboratorio
Modalità di richiesta analisi (analisi singole, analisi multiple, profili, esami funzionali, esami in urgenza, esami di screening)
Percorso informativo: dall’identificazione del paziente al referto
Fase preanalitica, analitica, post-analitica
Materiali biologici
Anticoagulanti
Generalità sui metodi di misura
Marcatori del profilo epatico: GOT, GPT, GGT, ALP, bilirubina tot. e coniugata, albumina, proteine tot.,LDH, alfa1antitripsina, ceruloplasmina, ammonio.
Marcatori della funzionalità renale: creatinina, clearance della creatinina, azotemia, azoto ureico, acido urico.
Elettroliti: sodio, potassio, cloro.
Esame urine completo: esame chimico-fisico, lettura della parte corpuscolata.
Indicatori del profilo lipidico: colesterolo, trigliceridi, HDL, LDL, apolipoprotein
Indicatori del metabolismo glucidico: glucosio, curve di tolleranza al glucosio.
Plasmaproteine: proteine della fase acuta, della fase anti-acuta, di trasporto, apolipoproteine, proteine del complemento, immunoglobuline.
Profilo emostatico: test coagulativi di base (tempo di Quick, tempo di tromboplastina parziale attivata).


Modulo II
(CFU 2, Sabina Cauci)

OBIETTIVO SPECIFICO
Obiettivo del corso è quello di fornire allo studente la conoscenza dei principali criteri per la valutazione della qualità analitica degli esami diagnostici di biochimica clinica, nonché le modalità di messa a punto di nuovi saggi molecolari in ambito diagnostico.

PROGRAMMA DEL CORSO
Introduzione alle analisi cliniche. Variabilità biologica intra- ed inter-individuale, analitica e totale. Affidabilità delle misure di medicina di laboratorio. Qualità delle misure di laboratorio e turn-around time (TAT). La valutazione dell’errore nella fase pre-analitica, analitica e post-analitica. La qualità nelle misure di laboratorio: documento di consensus della Conferenza di Stoccolma IUPAC, IFCC,WHO sulla qualità delle misure di laboratorio. Errore analitico ed errore totale di laboratorio.
Valutazione e standardizzazione dell'errore pre-analitico. Esempi di insidie pre-analitiche. Effetti del ritmo circadiano. Effetto di interferenti. Campioni che il laboratorio deve rifiutare. Imprecisione analitica e variabilità biologica. Punto omeostatico. Variabilità intra- (Vi) ed inter-individuale (Vg). Metodi analitici con performance di variabilità analitica CVa minima, desiderabile e ottimale definite in base alla variabilità individuale CVi. Algoritmo per il calcolo della Variabilità Totale (CVt) in base alla CVi e CVa. Come incide la CVa sulla CVt. Esercizi. Qualità analitica nella "fase analitica". Imprecisione, bias ed errore totale. Controlli di qualità interni ed esterni. Traguardi di qualità analitica. Definizione dei livelli ottimali, minimi, ed ottimali per imprecisione, bias ed errore totale in base alla variabilità biologica. Esercizi. Variabilità biologica informazioni derivate. Differenza critica (CD): come decidere se due misure consecutive di un certo analita sullo stesso paziente sono significativamente diverse. Esercizi. Indice di Individualità, come decidere se servono intervalli di riferimento stratificati. Problemi ancora aperti sulla determinazione della variabilità intra-individuale e inter-individuale in età
pediatrica ed in specifiche patologie.
Esame emocromocitometrico. I tre parametri di base: emocromo,emoglobina,numero dei globuli rossi. Gli indici eritrocitari: MCV,MCH,MCHC,RDW. Significato, modalità di misura e valori di riferimento. Variazioni dei valori di riferimento della Hb e del Hct in funzione dell'età,genere,settimane di gravidanza. Il problema della armonizzazione fra laboratori diversi: confronto dei valori di riferimento per i parametri dell'emocromo in 3 laboratori di analisi cliniche del FVG e 1 laboratorio certificato ISO del Veneto ed 1 laboratorio canadese. Alterazioni caratteristiche degli eritrociti valutabili strumentalmente o visibili al microscopio. Come calcolare MCH, MCHC, MCV in base ai valori di Hb, Hct e RBC. Esercizi. Reticolociti. Effetti della eritropoietina. Eritropoiesi inefficace. Diverse classificazioni usate per le anemie. Grado di severità nelle anemie. Definizione di anemia nella popolazione maschile e femminile.
Evoluzione biotecnologica dei Biomarcatori della carenza marziale. Anemie microcitiche: la anemia sideropenica. Il bilancio del ferro. Modalità di assorbimento del ferro, differenze fra ferro eme e non-eme. Cause principali di carenza marziale. Frequenza di anemia da carenza marziale nei maschi adulti e nelle donne fertili. Quadro generale dei biomarcatori plasmatici del deficit di ferro. Variabilità biologica della sideremia, transferrina e percentuale di saturazione della transferrina. Esercizi. Nuovi marcatori nelle anemie sideropeniche. Il recettore solubile della transferrina e il sTfR-F index. Dati di sensibilità, specificità ed efficenza dei diversi marcatori per lo status del ferro in giovani donne italiane, anche in base all'uso di pillola contraccettiva.
Biomarcatori nelle emoglobinopatie: Anemie da mutazioni puntiformi. Tipi diversi di emoglobine e catene globiniche alfa e beta presenti dal momento del concepimento all'età adulta: emoglobine embrionali,HbF,HbA1,e HbA2. Emoglobinopatie causate da mutazioni puntiformi: HbS,HbC,HbE,HbD. Diversità di profilo elettroforetico delle emoglobine in soggetti normali,con tratto falciforme/C/E,ed omozigoti con mutazioni puntiformi. Manifestazioni e profilo biochimico di soggetti etero o omozigoti per anemia falciforme. Valori tipici
di emoglobina,reticolociti,bilirubina. Metaemoglobinemie indotte ed ereditarie. Corpi di Heinz. Talassemie. Anemie ereditarie quantitative: le alfa- e beta-talassemie. Parametri sierici tipici dei soggetti omozigoti o eterozigoti per alfa-talassemia. Livelli di emoglobina di Bart e HbH nelle alfa-talassemie. Biomarcatori nelle beta-talassemie e confronto con altre anemie microcitiche. Parametri sierici tipici dei soggetti omozigoti o eterozigoti per beta-talassemia. Livelli di HbA2 e HbF nei soggetti beta-talassemici ed altri indicatori tipici per l'individuazione del tratto beta-talassemico. Valori tipici di Hb,MCV,MCH,RDW e reticolociti nei mono- ed eterozigoti
talassemici. Confronto con altre anemie microcitiche, da carenza marziale e da infiammazione cronica,profili caratterizzanti di biomarcatori sierici. Metodi biotecnologici per distinguere i vari tipi di emoglobinopatie. Profili Elettroforetici a pH diversi. Tecniche HPLC per distinguere le varie emoglobine. Inteferenza della varianti emoglobiniche per il dosaggio della Hb glicata. Come differenziare le anemie microcitiche dovute a deficit di ferro rispetto a quelle talassemiche. Esempi di casi clinici di profili ematologici sierici in anemie microcitiche.
Biomarcatori nell'infarto del miocardio. Evoluzione biotecnologica nei saggi per le troponine.
Biomarcatori: il contributo alla diagnosi delle patologie ischemiche del cuore. Importanza e caratteristiche degli indicatori biochimici sierici per l'infarto del miocardio e nelle malattie cardiache. Esami di laboratorio nella diagnosi dell'infarto acuto del miocardio (AMI) e nella sindrome coronarica acuta (ACS). Finestre diagnostiche. Indicatori biochimici precoci e tardivi. Approccio diagnostico con l'impiego combinato e seriale di diversi analiti.
Caratteristiche,sensibilità,specificità,valore prognostico dell'esame nel siero di mioglobina,creatin chinasi (CK) totale e frazione CK-MB. Significato del CK-MB index. Le troponine cardiache. Significato diagnostico e prognostico di Myo, CK-MB, cTnI e cTnT. Indicazioni IFCC per i valori di riferimento di Myo, CK-MB e Troponine. Significato della misura degli indicatori tardivi: latticodeidrogenasi (LD),rapporto LD1/LD2,e catene leggere e pesanti della miosina cardiaca.
Esempio di validazione di un metodo biochimico per la diagnostica clinica. Procedure sperimentali per la messa a punto di un metodo analitico per la misura della concentrazione della Troponine cardiaca I secondo le indicazioni delle linee guida IFCC del 2007 ed in base alle nuove evidenze scientifiche emerse nel 2010 ai fini della diagnosi di danno miocardico. Come l'imprecisione totale di un test analitico influenza l'uso clinico del test. Variabilità di risultati ottenuti con i diversi saggi commerciali per la determinazione della cTnI e cTnT. Come l'imprecisione a concentrazioni vicine al cut-off influenzano il numero di misdiagnosi. Insidie e cause di variabilità pre-analitiche ed analitiche. Il problema della stabilità dell'analita. Scelta degli epitopi. Calibrazione. Quali diversi ostacoli sono ancora da superare per il raggiungimento dei traguardi ottimali di performance analitica in accordo con le evidenze più recenti.
Definizione e determinazione del limite del bianco (LoB), limite di detection (LoD), limite di quantificazione (LoQ). Problemi di messa a punto di un test biotecnologico a scopi diagnostici: interferenti ed anticorpi eterofili. Sviluppi biotecnologici in test analitici per fattori di rischio cardiovascolare.
Omocist(e)ina: Modalità di misura della omocisteina totale. Il problema degli intervalli di riferimento per la Hcy. Quando e come utilizzare i saggi per la omocisteina. Iperomocisteinemia moderata,intermedia e severa. Stili di vita ed alimentazione che inducono livelli elevati di omocisteina. Rischio di mortalità da malattia cardiovascolare, rischio di esiti avversi in gravidanza e rischio di demenza senile associati a livelli progressivamente elevati di omocisteina.
Evoluzione biotecnologica nei marcatori di fase acuta. Il caso della Proteina C reattiva (CRP): cenni sulla struttura e ruolo biologico. Dalla scoperta della CRP all'uso diagnostico di questo biomarcatore. Biomarcatori dosabili nel sangue per la fase acuta. L'importanza del LoD basso. Perchè la CRP sta soppiantando altri esami come la VES. Intervalli di riferimento della CRP. Evoluzione dei test per la CRP; differenze fra i test tradizionali per la CRP a bassa sensibilità ed i saggi con limite di detection molto basso per il dosaggio della CRP ad alta sensibilità (hsCRP).
Importanza del dosaggio della HCY e hsCRP per la valutazione della infiammazione cronica di basso grado; ORs relativi a rischio di patologie cardiovascolari associati a diversi livelli di hsCRP. Confronto fra HCY, hsCRP,colesterolo,fumo e pressione sistolica arteriosa come fattori di rischio di patologie cardiovascolari. Differenze fra gli studi prospettici europei ed americani. Effetti dell'uso di trattamenti ormonali sui livelli di HCY e hsCRP in giovani donne italiane. L'approccio attuale e prospettive future di determinazione simultanea di fattori di rischio multipli per il rischio di malattia coronaria.
 

Modulo III
(CFU 2, Antonio Beltrame)
 

PROGRAMMA DEL CORSO

1. Metodi di patologia molecolare
2. Patologie genetiche:
a. Patologie cardiovascolari,
3. Neoplasie ereditarie:
a. Carcinoma mammario ereditario,
b. Poliposi adenomatosa familiare, Sindrome di Turcot e di Peutz-Jeghers,
c. Cancro colonrettale ereditario non-poliposico,
d. Neoplasie endocrine multiple (MEN),
e. Neurofibromatosi,
f. Mutazioni di TP53 e sindrome di Li-Fraumeni,
g. Sindrome di von-Hippel Lindau.
4. Tumori solidi:
a. Carcinoma mammario,
b. Carcinoma uroteliale,
c. Gliomi,
d. Identificazione molecolare di neoplasie occulte.
5. Ematopatologia neoplastica:
a. Leucemia mieloide acuta,
b. Leucemia acuta linfoblastica,
c. Linfomi B,
d. Linfomi T,
e. Disordini mieloproliferativi e sindromi mielodisplastiche

 

 

Bibliografia

MODULO I
Saranno fornite agli studenti copie delle slide.
Testi di riferimento:Covelli-Spandrio; Medicina di Laboratorio o qualunque testo di Medicina di Laboratorio.

MODULO II
BIBLIOGRAFIA:
• Panteghini M. Interpretazione degli esami di laboratorio. Piccin ed. 2008
• Galzigna, Plebani. Biochimica clinica generale. Piccin ed. 2010
BIBLIOGRAFIA DI APPROFONDIMENTO:
• Balestrieri, D’Amora, Giordano, Napoli, Pavan. Diagnostica Molecolare nella Medicina di Laboratorio
Piccin ed. 2009

MODULO III
MOLECULAR PATHOLOGY IN CLINICAL PRACTICE; DEBRA G.B. LEONARD (EDITOR) SPRINGER
LE BASI PATOLOGICHE DELLE MALATTIE; ROBBINS E COTRAN; ELSEVIER
 

 

Modalità d'esame

La valutazione del profitto sarà effettuata mediante prova scritta comprendente domande a risposta aperta.