Lezioni ed esercitazioni

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Esercitazioni di calcolo

Calcoli per la preparazione di soluzioni; calcolo del grado di competenza di cellule batteriche; calcolo della concentrazione di acidi nucleici in soluzione mediante misure spettrofotometriche e a fluorescenza; calcolo della concentrazione di un composto mediante lettura spettrofotometrica; calcolo della concentrazione di proteine mediante saggio colorimetrico di Bradford.

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La tecnologia del DNA ricombinante

Lezioni frontali: 5h

Crescita e selezione di colture batteriche procariotiche. I plasmidi batterici: caratteristiche e classificazione dei batteri naturali. Plasmidi non integrativi ed episomiali. La coniugazione batterica. I batteriofagi: caratteristiche principali. Ciclo litico, lisogenico e ciclo del fago M13. Plasmidi ingegnerizzati: caratteristiche principali ed elementi caratterizzanti. Trasformazione batterica: definizione e metodi per effettuarla. Misurazione della crescita batterica e quantificazione della quantità di batteri in una coltura. La trasformazione batterica: definizione, protocollo per la trasformazione batterica e calcolo dell’efficienza di trasformazione. Lisi batterica e purificazione del DNA: lisi chimica e lisi fisica. Estrazione organica mediante fenolo, purificazione mediante scambio ionico e purificazione mediante guanidinio tiocianato. Purificazione di DNA plasmidico: lisi alcalina con estrazione con solventi organici, precipitazione su gradiente di cloruro di cesio e metodi cromatografici. Quantificazione di acidi nucleici mediante lettura spettrofotometrica. Strategie di clonaggio ed identificazione dei cloni ricombinanti. Enzimi utilizzati nel clonaggio: la ligasi, la fosfatasi alcalina e gli enzimi di restrizione. Clonaggio blunt e clonaggio direzionale. Utilizzo di estremità coesive nei clonaggi: linkers, adattatori e code omopolimeriche. La reazione di ligasi: preparazione di vettore ed inserto e i controlli. Metodi di screening di una reazione di ligasi: PCR, digestione enzimatica ed inattivazione inserzionale. Sistemi basati sull’inattivazione del gene lacZ. Vettori fagici: il fago λ. Preparazione di una sospensione di fagi, induzione mediante controllo della temperatura, raccolta di una coltura infetta. Il packaging in vitro: sistema a singolo ceppo e a doppio ceppo. Infezione fagica e screening dei fagi ricombinanti: inattivazione inserzionale del gene lacZ e del gene cI, fenotipo Spi e selezione per dimensione del genoma. Utilizzo del fago λ come vettore di clonaggio: vettori di inserzione e di sostituzione. Il fago M13: infezione e ciclo replicativo. Isolamento del DNA del genoma del fago M13. Il genoma del fago M13 e le sue modifiche. Vettori ibridi: i cosmidi, i fagemidi.

Esercitazioni: 22h

- Preparazione di terreni e piastre per la crescita di batteri;

- Trasformazione di batteri competenti TOP10 e piastra tura su terreni selettivi;

- Calcolo dell’efficienza di trasformazione dei batteri ricombinanti;

- Isolamento di DNA plasmidico mediante mini-prep;

- Calcolo della concentrazione di DNA plasmidico mediante lettura spettrofotometrica;

- Analisi di restrizione di DNA plasmidico;

- Purificazione di DNA da gel di agarosio;

- Reazione di ligasi;

- Screening della reazione di ligasi mediante in situ PCR e digestione enzimatica.

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Creazione e screening di una genoteca

Genoteche a cDNA e a DNA genomico. Calcolo del numero di cloni ricombinanti necessari per coprire un intero genoma. Metodi per la creazione di frammenti di DNA. Vettori ad alta capacità per creazione di genoteche: λ ZAP, vettori BAC, il batteriofago P1 e vettori pYAC. Genoteche a cDNA: copiatura, eliminazione del filamento stampo e sintesi del complementare. Screening delle genoteche: metodi basati su sequenza e struttura/funzione. Analisi mediante ibridazione, il plaque lift, utilizzo di sonde biotinilate e coniugate con HRP. Analisi mediante PCR. Screening eterologo per l’individuazione di geni omologi. Analisi immunologica, analisi mediante South-western e North-western, complementazione funzionale e gain of funcion.

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Espressione di proteine ricombinanti in E.coli

Lezioni frontali: 6h

Parametri che influiscono nella scelta del sistema di espressione. Vantaggi e svantaggi della produzione di proteine ricombinanti in E.coli. Caratteristiche dei plasmidi per l’espressione di proteine ricombinanti: i vettori della classe pGEX e pET. Elementi regolativi essenziali per l’espressione di proteine ricombinanti in E. coli: il sistema a cassetta. I promotori: forti, deboli, inducibili, reprimibili. Promotori: lacZ, trpA, tac, λ Pl e T7. L’operone del lattosio e la regolazione positiva da cAMP (presenza/assenza di glucosio). IPTG come induttore analogo non metabolizzabile del lattosio. Proteine di fusione: vantaggi e svantaggi dell’espressione di una proteina ricombinante in fusione con una proteina batterica. Tag di fusione: GST, MBP, HisTag, FLAG peptide e relativi metodi di purificazione. Rimozione della proteina di fusione mediante proteolisi: Fattore X, Trombina e TEV protease (tobacco each virus protease). Carateristiche del ceppo E.coli BL21. Espressione di proteine ricombinanti in batch e con fermentatori. Parametri monitorati per il controllo della crescita/induzione. Quantificazione spettrofotometrica di un estratto proteico mediante il Saggio di Bradford. Calcolo dell’efficienza di espressine e purificazione di una proteina ricombinante. I vettori della classe pGEX: caratteristiche generali, metodi di purificazione di GST-tagged proteins e rimozione della GST-tag. La cromatografia di affinità con resina derivatizzata con glutatione ridotto. I vettori della classe pET: caratteristiche generali, metodi di purificazione di His-tagged proteins e rimozione della His-tag. Induzione dell’espressione basata sul promotore del batteriofago T7. La cromatografia di affinità con resina derivatizzata con Nichel. Svantaggi associati all’utilizzo di E. coli come sistema di espressione: assenza di splicing, terminazione precoce, codon usage, mancanza di PTMs, formazione di corpi di inclusione e necessità di protocolli di refolding.

Esercitazioni: 18h

- Trasformazione di cellule batteriche BL21(DE3);

- Curva di crescita ed induzione dell’espressione della proteina ricombinante;

- Lisi di cellule batteriche;

- Analisi di Slot-blot;

- Purificazione in batch della proteina ricombinante e quantificazione mediante saggio colorimetrico di Bradford;

- Analisi della purificazione su gel SDS-PAPGE e colorazione con Comassie;

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Espressione di proteine ricombinanti in sistemi eucariotici

Caratteristiche di un vettore eucariotico. I principali promotori eucariotici: GAL10, AXO, Glucoamilasi, Cellobioidrolasi. I sistemi di espressione in S.cervisiae e P.pastoris. e caratteristiche dei vettori utilizzati. La glicosilazione in S.cerevisiae e P.pastoris. Espressione di proteine ricombinanti in cellule di mammifero. Comparazione tra sistemi di espressione in batteri, batteri eucariotici e in cellule di mammifero. Elementi caratterizzanti un vettore di espressione eucariotico: i promotori CMV, SV40 e RSV. Metodiche per l’introduzione di DNA esogeno in cellule eucariotiche: sistemi virali, trasfezione, inieizione. Metodi di trasfezione con cloruro di calcio o liposomi. Sistemi di espressione inducibile: l’operatore Tet. Sistemi Tet-on e Tet-off: funzionamento, caratteristiche e vantaggi. Cenni sull’espressione di proteine ricombinanti in baculovirus e mediante sistemi di pharming.

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Analisi di espressione genica e proteica in cellule eucariotiche

La manipolazione dell'RNA. Fonti di RNase e precauzioni da adottare nei protocolli che prevedono l’utilizzo di RNA. Principio su cui si basa la PCR. Componenti e fasi della reazione: denaturation, annealing ed elongation. Caratteristiche dei primers e definizione della temperatura di melting (T_m). La Taq polimerasi: caratteristiche dell’enzima ed esempi di enzimi disponibili in commercio (Hot start, High fidelity, Fast PCR, Long PCR). La reazione di retro trascrizione: innesco con oligo dT, random esaprimers o primers a seqeunza specifica. Le trascrittasi inverse AMV, M-MLV, Tth: caratteristiche e condizioni di utilizzo. I controlli della reazione di RT-PCR. La PCR semiquantitativa e l’utilizzo di geni housekeeping come normalizzatori per stimare la quantità di RNA di partenza. I controlli della reazione di retro trascrizione e di PCR. Applicazione della PCR: la mutagenesi sito specifica, PCR in situ, e Proximity Ligation Assay. La Real time PCR: descrizione della tecnica e vantaggi rispetto alla PCR semiquantitativa. I concetti di thrashold cycle (C_T), fase esponenziale e di plateau. Interpretazione di un grafico di Real Time PCR. Applicazioni quantitative della Real time PCR: quantificazione assoluta e relativa. Principio di funzionamento delle tecnologie Sybr green e Taqman. Northern and Southern blot: procedura di separazione, trasferimento, ibridizzazione, rilevamento ed analisi. Il Western blot: fasi dell’immunoriconoscimento e sistemi di rilevazione della proteina. Il dot blot e l’utilizzo di sistemi di analisi dell’immagine per l’analisi quantitativa dei livelli di espressione proteica.

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Il silenziamento genico

Cenni storici sulla scoperta dell’RNA interference (RNAi). Aspetti biochimici correlati con il silenziamento genico basato sull’RNAi: Initiation step ed Effector step. Utilizzo dell’RNAi per il silenziamento genico specifico in cellule di mammifero: caratteristiche dei dsRNA e metodi di inserimento. Utilizzo dei vettori della classe pSUPER per il silenziamento genico transiente. Il silenziamento genico inducibile mediante l’utilizzo dei vettori della classe pTER. I controlli sperimentali degli esperimenti di silenziamento genico: scramble sequence, curva di titolazione, funzional resque.

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Totale ore lezioni ed esercitazioni

65

di cui di esercitazioni

45

Bibliografia

T.A. Brown 2007 “Biotecnologie molecolari”-Zanichelli, Bologna

Ulteriore materiale didattico verrà fornito dal Docente durante lo svolgimento del corso.

Modalità d'esame

1. Prova pratica di laboratorio

Consiste nel svolgere autonomamente un protocollo di laboratorio.

Tempo a disposizione: 2h

Valutazione: fino a 10 punti;

2. Prova scritta

Consiste nel risolvere degli esercizi di calcolo

Tempo a disposizione: 1h30’

Valutazione: fino a 10 punti;

3. Prova orale

L’esame orale verte su tutti gli argomenti trattati durante le lezioni.

Periodo: lo stesso giorno della prova scritta;

Valutazione: fino a 10 punti;

Note

- la prova pratica, una volta effettuata, verrà mantenuta valida e la valutazione sarà sommata a quella della prove scritta e orale;

- la prova scritta e orale vengono svolte lo stesso giorno;

- per accedere alla prova orale è necessario una valutazione minima di 5 punti su 10 nella prova scritta;

- Il voto minimo della prova orale è di 5 punti su 10: chi non raggiugesse il voto minimo è tenuto a ripetere entrambe le prove, scritta ed orale;

- Il voto finale del Modulo II sarà dato dalla somma dei voti acquisiti nelle tre prove.

Modalità di contatto con i docenti