Docenti

Claudio Schneider claudio.schneider@uniud.itRoberta Benetti roberta.benetti@uniud.itAntonella Bonetti antonella.bonetti@uniud.it

Crediti

13 CFU

Modulo “Biologia applicata”

(CFU 6, prof. Claudio Schneider)

• Introduzione alla cellula Procarioti ed eucarioti : diversità di organizzazione e basi comuni. Le membrane biologiche : struttura, funzioni, vantaggi e svantaggi. L'evoluzione della cellula ed evoluzione dei sistemi di membrana.

• Il mondo a RNA : autoreplicazione, trascrizione e traduzione Funzioni dell'RNA : catalisi e autoreplicazione. Dall'RNA alle proteine: evoluzione del processo di traduzione. Dall'RNA al DNA : trascrizione e replicazione.

• I compartimenti di membrana : organelli ed efficienza funzionale. organizzazione a compartimenti delimitati da membrana nelle cellule eucariotiche. Evvoluzione dei sistemi di membrana interni e vantaggi nell' efficienza funzionale. Gli svantaggi ed i meccanismi evoluti alla comunicazione tra i diversi comparti : la protein-chinesi

• Il citoscheletro. I vari tipi di citoscheletro negli eucarioti e loro omologhi nei procarioti. Dinamica della regolazione : polimerizzazione e depolimerizzazione : analogie tra microfilamenti e microtubuli. Regolatori e piccole proteine G.

• La matrice extracellulare e l'organizzazione pluricellulare I vari tipi di matrice extracellulare nella formazione di aggregati cellulari. I contatti cellula-cellula recettori di superficie(caderine) e relazione con il citoscheletro interno. I recettori delle proteine della matrice (integrine) e relazione con il citoscheletro. I movimenti Morfogenetici e regolazione.

• Evoluzione dei sistemi endomembrana ed il percorso secretorio Comunicazione tra i diversi comparti di membrana : il perorso secretorio e gli esperimenti di Palade

• L'inizio del percorso secretorio La proteina VSV-G e le tecniche attuali per seguire il percorso secretorio. Approccio biochimico e genetico nell'analisi del percorso secretorio. L'approccio biochimico nell'analisi dell'indirizzamento a ER : l'esperimento di protezione da proteasi e l'evidenza della sequenza segnale per l'esporto a ER

• I meccanismi della traslocazione co-traduzionale. Sequenza segnale e SRP : dal citoplasma alla membrana di ER. Struttura e funzioni di SRP : dal batterio all'elefante. Il recettore SR di SRP : la funzione del dominio G e dell'RNA di SRP per l'indirizzamento a ER. Ciclo di idrolisi di GTP e funzione successiva della sequenza segnale. Il traslocone : struttura e regolazione apertura-chiusura.

• Topogenesi delle proteine di membrana.La traslocazione post-traduzionale Le proteine di membrana Tipo I, II, III e IV : biognesi e loro topogenesi : sequenze di arresto/inizio traslocazione. La traslocazione post-traduzionale : vettorialità ed energetica rispetto alla co-traduzionale.

• Le funzioni di ER nel folding e processamento Il Reticolo Endoplasmatico : assistenza al folding e controllo di qualità. Gli chaperoni di ER. Modificazioni post-traduzionali in ER : la glicosilazione in N. La formazione dei ponti disolfuro.

• ERQC-ERAD Il controllo di qualità rispetto alla degradazione delle proteine non-foldate. La catena oligosaccaridica e l'indirizzamento a ERAD : glucosi terminali e mannosi come segnali x ERAD. La retrotraslocazione accopiata al sistema della ubiquitina nella degradazione ai proteasomi citoplasmatici. UPR e segnalazione ad ERAD.

• Da ER a VTC e Golgi L'inizio del traffico anterogrado : il problema dell'assortimento rispetto al movimento in ER. Il quadro globale dell'assortimento e dinamica dei comparti VTC e Golgi.

• Il traffico vescicolare : mantelli, assortimento-cargo e indirizzamento. Flusso anterogrado e retrogrado da ER a VTC. Mantelli COPII e COPI nella formazione delle vescicole di trasporto : identificazione via approccio biochimico e genetico. Il funzionamento dei mantelli nell'assortimento del cargo : recettori di membrana e segnali di sorting x i vari mantelli. Indirizzamento delle vescicole di trasporto : proteine tethers e Rab nella fase di riconoscimento di I livello e movimentazione lungo i microtubuli. IL complesso SNARE nel docking e fusione.

• Il VTC e assortimento retrogrado : dal VTC a GOLGI. Origine e dinamica del VTC : prima stazione di concentrazione del cargo secretorio. Origine e dinamica del Golgi : la progressione cisternale versus il compartimento stabile. Le proteine del Golgi : meccansimo di retenzione. Funzioni del Golgi nel processamento della catena oligosaccaridica in N, seganel M6P, glicosilazione in -O, sintesi degli sfingolipidi e glicosfingolipidi. Il gradiente lipidico e sorting. Flusso anterogrado da TGN e mantello di clatrina. Formazione delle vescicole secretorie regolate.

• L'omeostasi del colesterolo. Il controllo della sintesi del colesterolo : SREBP e suo meccanismo di regolazione. SCAP-INSIG , concentrazione del colesterolo/SSD. Processamento di SREBP e trascrizione LDLR, HmGCoAR. Il gradiente del colesterolo e sue funzioni : comparto endosomiale e Plasma membrana.

• Il comparto endosomiale. Endocitosi da PM ed endosomi precoci : LDL e Tf. Maturazione degli endosomi a MVB e sistema ESCRT. L'indirizzamento degli enzimi lisosomiali da TGN. Maturazione dei lisosomi.

• Riciclo nel comparto endosomiale ed autofagia. Gli endosomi da riciclo e traffico Golgi-PM. Riciclo tra endosomi tardivi e TGN : il retromero. Il processo dell'autofagia e sua regolazione.

• La trasduzione dei segnali. Generalità della segnalazione. Ligandi e recettori di membrana : affinità e numero dei recettori nella regolazione della risposta : Kd e Vmax. L'endocitosi dei recettori e regolazione della sensibilità alla risposta. Gli endosomi come piattaforme di trasduzione del segnale.

• Percorsi di trasduzione del segnale : amplificazione del segnale e chinasi. Generalità sui percorsi di trasduzione del segnale. I recettori GPCR : proteine G-trimeriche ed effettori :generazione dei secondi messaggeri cAMP, IP3 + Ca. Attivazione delle chinasi PKA e PKC. Loro bersagli e risposte specifiche. Chinasi : struttura e regolazione. Labbro di attivazione, sua regolazione nella formazione del sito catalitico. PKA e Generalità x altre chinasi.

• I fattori di crescita ed i recettori tirosin-chinasi L'attivazione dei TRK : dimerizzazione ed attivazione. Da TRK a Ras a MAPK : il percorso delle MAPK e loro funzione nell'inizio della fase G1 del ciclo di divisione. L'attivazione di PI3K ed il percorso di PKB-mTOR. Incrocio con la regolazione dell'autofagia.Insulina-TRK IRS, diabete e autofagia. Autofagia e longevità.

• Citochine-STAT, TGF-BMP e SMAD Citochine e recettori : trasduzione via attivazione di JAK. JAK e attivazione di STAT : accoppiamento tra proliferazione e differenziamento nella cascata della gerachia differenziativa. La famiglia TGF-beta . Attivazione dei recettori e fosforilazione SMAD : controllo della proliferazione e plasticità cellulare via EMT. nella morfogenesi dello sviluppo. Le cellule staminali e EMT.

• WNT e SHH nella morfogenesi e sviluppo embrionale. La trasduzione attraverso la regolazione dei livelli quantitativi di fattori/cofattori trascrizionali. Wnt e recettori nella regolazione del livello di beta-catenina : ruolo della beta-catenina come cofattore trascrizionale. SHH e recettori nella regolazione di GLI, fattore trascrizionale. Wnt/bet-catenina e la regolazione del comparto staminale dell'epitelio intestinale e tumorigenesi.

• L'adesione cellula-cellula e la matrice-extracellulare nell'organizzazione pluricellulare. Logica ed evoluzione dell'organizzazione pluricellulare : le molecole di adesione sulla superficie ed i vari tipi di adesioni. Le caderine e l'organzizzazione del citoscheletro cellulare attraverso beta-catenina : ruoli nei movimenti morfogenetici. Le funzioni della matrice cellulare : l'adesionemediata da integrine. La segnalazione delle integrine e adesioni focali : ruolo nel movimento cellulare.

• Il citoscheletro di actina : meccansimi di regolazione. La polimerizzazione dell'actina ed il treadmilling : polo+ e polo-. Le proteine nucleatrici : formine e ARP. Regolazione dinamica e morfologia dei filamenti di actina : crociati vs longitudinali. Regolazione a monte della nucleazione e piccole-G : Rho, Rac e Cdc42 nel movimento fibroblastoide.

• I microtubuli e loro funzioni nel movimento e traffico intracellulare. La regolazione dinamica dela polimerizzazione dei microtubuli : il modello dell'instabilità dinamica. Il CAP-GTP e le proteine che lo legano : EB1. Il polo- e la gamma-tubulina e complesso TURC. Le proteine motrici (dineine e chinesine) e loro ruolo nel traffico vescicolare. Microtubuli e regolazione delle adesioni focali.

• Microtubuli e mitosi.La meccanica della mitosi : organizzazione del fuso mitotico e dinamica dei microtubuli. Polimemrizzazione dei microtubuli : dai cinetocori agli astri verso la PM. L'anafase e la movimentazione dei cromosomi : regolazione da parte del complesso APC. Checkpoint mitotico.

• Il ciclo di divisione e sua regolazione. Modelli animali nell'analisi del ciclo cellulare : le fasi e transizioni. Cicline e cdk : regolazione trascrizionale delle cicline e post-trduzionale delle cdk. Attivazione e inibizione delle cdk. Cdk in G1, S e G2 accoppiate alle relative cicline. Ruolo di Rb come effettore a valle della regolazione di E2F nell'ingresso in G1 e transizione G1/S. Le origini di replicazione ed i complessi di pre-replicazione : il blocco alla reduplicazione. Regolazione del ciclo e tumori.

• Epigenetica e riprogrammazione genomica.L'epigenetica : definizione ed esempi. La cromatina e meccanismi di regolazione : il codice istonico. Modificazioni del DNA e loro effetti sull'organizzazione della cromatina. Le ES, I fattori di Yamanaka e la riprogrammazione staminale. RNA ed epigenetica : il caso dei miRNA. La plasticità epigenetica in relazione alla staminalità : ruolo nella tumorigenesi.

• I checkpoints del ciclo e l'apoptosi: I vari checkpoint del ciclo cellulare in G1, S/G2, G2 e mitosi. Attivatori ed effettori : chinasi e fattori di trascrizione. Il ruolo di p53. Arresto del ciclo vs apoptosi. Genralità sull'apoptosi rispetto a necrosi : la via intrinseca e la via estrinseca. Le caspasi come effettori e loro regolazione.
 

Modulo “Biologia applicata”

(CFU 5, prof. Benetti Roberta)

Parte TEORICA

L’epigenetica
• Definizione e caratteristiche differenziative tra genetica ed epigenetica.
• Molteplici livelli di controllo dell'espressione genica negli eucarioti.
• I principali meccanismi epigenetici: reversibilità dei processi epigenetici e importanza nello
sviluppo; Rimodellamento della cromatina durante il ciclo cellulare.
• La metilazione del DNA e le DNMT1, DNMT3a e DNMT3b.
• Gli istoni e il codice istonico.
• Controllo a distanza dell'espressione genica, l'effetto posizione.
• i telomeri
• L'imprinting genetico; sindromi diPrader-Willi e Angelman.
• L'inattivazione del cromosoma X e le diverse tappe nel suo processo. XiST e TSIX.
• Gli RNA non codificanti.
• Epigenetica come fenomeno reversibile; La sindrome di Turner
• Il DNA genomico e le sue alterazioni epigenetiche nei tumori
• Alterazione della metilazione del DNA nel cancro.
• Endonucleasi di restrizione. Enzimi sensibili al grado di metilazione del DNA.
• Coloranti inerti per la visualzzazione del DNA in una corsa elettroforetica.

Le fasi del ciclo cellulare, l’apoptosi e i microtuboli
• I microtubuli, le loro caratteristiche e le loro proprietà.
• La sensibilità a sostanze anti-mitotiche.
• L'arresto della cellula in mitosi attraverso l'utilizzo del taxolo; modalità di azione del
taxolo.
• L’apoptosi e i modelli di rilevamento dell’apoptosi.

I Telomeri
• I telomeri e le telomerasi.
• Il problema della replicazione delle estremità 3'.
• Accorciamento dei telomeri, invecchiamento e tumori

L'RNA interference
• L'RNA non codificante e la sua importanza nella definizione della cromatina.
• Transcriptional Gene silencing (TGS) e Post Transcriptional Gene Silencing (PTGS)
• SiRNA, Dicer e miRNA: pathways, differenze e meccanismi d'azione.

La genomica funzionale
• La trascrittomica.
• Descrizione delle tecnologie impiegate nella caratterizzazione del trascrittoma: SAGE,
CAGE, GIS, MPSS.
• Librerie cDNA a lunghezza completa.
• Le tecnologie cDNA-microarray e oligo-array. Il loro impiego nello studio dei profili di
espressione genica. Tecniche per l'analisi dell'espressione dei microRNA
• microRNA microarray: tecniche per l’analisi dell’espressione dei microRNA.

Parte PRATICA

Le colture cellulari
• Le tecniche delle colture cellulari in vitro
• allestimento di una coltura cellulare; terreni di coltura, loro caratteristiche e proprietà.
• L'emocitometro e le diluizioni cellulari.
• La sicurezza nei laboratori: norme ed accorgimenti
• I microrganismi inquinanti, prevenzione e cura degli inquinamenti.
• Passaggio delle cellule in coltura. Ogni gruppo mette in coltura un tipo cellulare differente
per valutare nella lezione successiva l'origine femminile, maschile, diploide o poliploide
attraverso il riconoscimento dell’inattivazione del cromosoma X e la visualizzazione/conta
dei corpi di Barr.
• La tecnica dell'immunofluorescenza; metodo diretto e indiretto; antigeni-anticorpo.
• Visualizzazione dell'eterocromatina costitutiva (condensata durante l'interfase) ed
eucromatina (decondensata durante l'interfase).
• I plasmidi ad espressione Le tecniche di trasfezione: precipitazione con calcio fosfato,
lipofezione, elettroporazione, microiniezione, trasferimento genico mediato da virus.
• Trasfezione con calcio fosfato di plasmidi codificanti shRNA di p53 e shRNA di Rb1.
• La tecnica di trasferimento proteico su membrana di nitrocellulosa
• Trattamento di cellule in coltura con agenti apoptotici. Passato il tempo opportuno, conta
cellule apoptotiche con saggio del Tripan blue e relativa analisi statistica.
• Estrazione di DNA genomico da culture cellulari primarie e tumorali. Digestione con enzimi
sensibili o meno alla metilazione del DNA, corsa elettroforetica su gel di agarosio e
conclusioni.

Genomica funzionale
• Estrazione dell’RNA totale da colture cellulari. Trattamento con DNAsi ed analisi
quantitativa mediante gel-agarosio. Trattamento con DNasi ed analisi quantitativa
dell’RNA ottenuto allo spettrofotometro.
• RT-PCR: sintesi di cDNA e amplificazione di geni selezionati.
• cDNA microarray: sintesi del cDNA target mediante oligo random secondo il metodo di
marcatura indiretto (AA-dUTP). Analisi elettroforetica ed interpretazione dei dati.
• Analisi finale dell’immagine microarray dell’ibridazione ottenuta con il cDNA preparato nel
corso dell’esercitazione.

Modulo: “Embriologia”

(CFU 2, prof. Bonetti Antonella)

Finalità

Acquisire conoscenze sulle modalità maturative delle cellule germinali e le loro prerogative. Acquisire conoscenze sul fenomeno della fecondazione “in vivo”, sulle procedure e problematiche della fecondazione “in vitro”. Acquisire conoscenze sull’evoluzione del concepito durante le prime fasi di sviluppo, sull’evoluzione e struttura degli annessi embrionali.

Programma 

Riproduzione agamica e riproduzione sessuata. Tappe fondamentali dello sviluppo e loro cronologia. Mitosi e meiosi. Gametogenesi: spermatogenesi, ovogenesi e loro regolazione ormonale. Attività secretiva delle gonadi maschili e femminili; caratteri strutturali delle vie genitali maschili e femminili. Follicologenesi, ovulazione e corpo luteo. Ciclo mestruale, ciclo miometrale, ciclo cervicale, ciclo tubarico e ciclo vaginale. Fecondazione, zigote e determinazione del sesso. Procedure di fecondazione “in vitro”. Segmentazione: genesi e impianto della blastocisti. Annessi embrionali: significato funzionale di sacco amniotico, sacco vitellino ed allantoide. Sviluppo e significato funzionale della placenta. Gastrulazione e significato dei foglietti embrionali nell’uomo.

ESERCITAZIONI

Attività di auto-apprendimento guidato al microscopio ottico.

Bibliografia

Rosati P, Maraldi NM, Embriologia generale, EdiErmes
Casasco E, Embriologia generale, la Goliardica Pavese Ed.
Barbieri M, Carinci P, Embriologia, Casa Ed. Ambrosiana

Modalità d'esame
 

Prova scritta