Docenti

Gianluca Tell gianluca.tell@uniud.itCarlo Vascotto carlo.vascotto@uniud.it

Crediti

12 CFU

Finalità

Comprensione del rapporto tra struttura ed attività nelle macromolecole di interesse biologico. Comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della trasmissione, espressione ed evoluzione dei caratteri ereditari della cellula e del mantenimento della stabilità genomica.
Fare acquisire allo studente le competenze per la comprensione dei meccanismi con cui viene regolata l’espressione dei geni nei procarioti e negli eucarioti, in relazione a processi quali la proliferazione ed il differenziamento cellulare, nello sviluppo embrionale e nella maturazione anticorpale, e delle modalità per inibire selettivamente l’espressione genica nonchè il ruolo di molecole di RNA non-codificante.

È articolato in lezioni frontali affiancate ad esperienze di laboratorio, in cui lo studente ha modo di applicare le nozioni circa le metodologie base utilizzate nell’ambito della Biologia Molecolare quali: le tecnologie del DNA ricombinante (plasmidi e loro analisi, purificazione e manipolazione, le strategie di clonaggio di un gene, librerie genomiche e di espressione), la manipolazione dell’espressione genica nei procarioti e la mutagenesi mirata, l’espressione di proteine ricombinanti in procarioti ed eucarioti, le metodologie per l’analisi di espressione genica (RNA e proteine) e dell’interazione proteina-proteina, le tecniche per il silenziamento genico. Ogni esperienza di laboratorio è preceduta da un’introduzione che illustra sia l'obiettivo da perseguire e l’abilità da acquisire, sia gli strumenti e i reagenti da usare. Ogni esperienza inoltre è seguita dalla discussione dei dati ottenuti.

Prerequisiti: Gli studenti devono aver seguito i corsi di Chimica Generale, di Chimica Organica, Fisica, Biochimica.

Programma dettagliato

Parte Teorica (7 cfu, 70 ore)
1. Struttura primaria, secondaria e terziaria degli acidi nucleici. La struttura B del DNA. Le altre strutture ordinate stabili del DNA. Come la sequenza delle basi e le condizioni ambientali (pH, forza ionica, composizione solvente, temperatura) influenzano la stabilità delle strutture ordinate. I vari modi con cui si denatura il DNA. La denaturazione termica. Rinaturazione e ibridazione. La termodinamica e la cinetica dell’ibridazione. L’interazione DNA-proteine. Come alcune proteine leggono la sequenza delle basi. Le proprietà topologiche dei DNA chiusi. Il meccanismo di azione delle topoisomerasi. Metodi di sequenziamento del DNA. Metodi automatici di sequenziamento. L’amplificazione del DNA: la PCR. Gli enzimi di modificazione del DNA: endonucleasi, esonucleasi, le chinasi, le fosfatasi, le ligasi. Principi base sulle tecnologie del DNA ricombinante. Vettori per il clonaggio di geni. Plasmidi e batteriofagi. Purificazione e manipolazione di DNA plasmidico. Gli enzimi di restrizione e di modificazione, caratteristiche, tipi e modalità di funzionamento. La struttura secondaria degli RNA. Le ribonucleasi specifiche ed aspecifiche. Metodi sperimentali per la separazione degli acidi nucleici: l’elettroforesi su gel e la centrifugazione. La struttura dei cromosomi. Il genoma dei procarioti e degli eucarioti. Il genoma umano. Il genoma mitocondriale. La cromatina. Gli istoni. I nucleosomi. Replicazione del DNA. Le proprietà delle DNA polimerasi procariotiche ed eucariotiche. Inizio della replicazione e componenti dell’apparato di replicazione. Fedeltà della replicazione. Il meccanismo molecolare della replicazione. I telomeri e le telomerasi.
2. Lesioni e riparazione del DNA. I meccanismi molecolari dei vari tipi di riparazione nei procarioti e negli eucarioti (MMR, BER, NER, NHEJ, Ricombinazione). Riparazione post-replicazione. La riparazione associata alla trascrizione.
3. La trascrizione. RNA polimerasi procariotiche ed eucariotiche. Il meccanismo di inizio della trascrizione nei procarioti e negli eucarioti. I fattori di trascrizione. Attivatori e repressori della trascrizione. I promotori, i potenziatori (enhancers), il mediatore negli eucarioti. La regolazione della trascrizione nei procarioti (gli operoni) e negli eucarioti. Gli ormoni peptidici e gli ormoni steroidei: meccanismo di controllo della trascrizione negli eucarioti. L’influenza della struttura della cromatina sulla trascrizione. Come viene modificata l’interazione tra istoni e DNA nella cromatina: l’acetilazione e la deacetilazione. La metilazione degli istoni e del DNA. I rimodellatori della cromatina. Le isole CpG. Eterocromatina ed eucromatina. L’imprinting e l’epigenetica. Gli isolatori.
4. Maturazione e turnover dell’RNA: la maturazione dell’mRNA eucariotico. Splicing, splicing alternativo, editing e stabilità dell’mRNA. La degradazione dell’RNA eucariotico: i pathways di degradazione. Il decapping e la deadenilazione. I P-bodies. I granuli di stress, i granuli di trasporto, i granuli polari, i granuli germinali. Il trasporto dell’ mRNA attraverso i pori nucleari. La degradazione mediata dal non-senso (NMD) e le sue conseguenze sulle patologie umane. L’esosoma: costituzione e funzione. La degradazione non-stop (NSD). La degradazione no-go (NGD).
5. I microRNA e lo short interfering RNA (siRNA). Il ruolo di miRNA e siRNA nel controllo dell’espressione genica. Il complesso RISC. Gli RNA non codificanti (ncRNA). Il progetto ENCODE. L’uso dei tiling arrays.
6. Sintesi proteica. Il codice genetico. Struttura e funzione dei tRNA. Struttura e funzione dei ribosomi. Il meccanismo di sintesi. La regolazione della sintesi proteica. La spesa energetica della sintesi proteica. La stabilità e il turnover delle proteine.
7. Approcci globali nell’analisi dell’espressione genica: la trascrittomica (microarrays) e la proteomica.
8. I meccanismi genetici dello sviluppo embrionale. Strategie di regolazione genica differenziale durante lo sviluppo: la localizzazione dell’mRNA, il contatto cellula-cellula, il gradiente dei morfogeni. Lo sviluppo di Drosophila: la formazione degli assi, i geni gap, pair-rule e omeotici. I geni Hox nei mammiferi. La determinazione del sesso negli insetti e nei vertebrati. L’adesione cellulare nello sviluppo. Le vie principali di segnalazione nello sviluppo.
9. La ricombinazione sito-specifico: i geni delle immunoglobuline e dei recettori dei linfociti T.

Parte Metodologico-sperimentale-pratica (5 cfu, 75 ore di laboratorio)

1. LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE. (Capitoli 2-9, Brown T.A. 2007-Zanichelli, Bologna; Capitoli 4-5, Glick BR, Pasternak J.J. 2003-Zanichelli, Bologna)
Vettori per il clonaggio di geni. Plasmidi e batteriofagi. Purificazione e manipolazione di DNA plasmidico.
Gli Enzimi di restrizione e di modificazione, caratteristiche, tipi e modalità di funzionamento.
I Vettori di clonaggio e i vettori di espressione: caratteristiche e loro utilizzo.
Creazione e screening di una genoteca.
Vettori basati sul batteriofago , M13. Cosmidi e fagmidi.
Vettori di espressione in cellule eucariotiche: caratteristiche ed utilizzo
Trasformazione genetica dei procarioti.
Sintesi chimica, sequenziamento e amplificazione del DNA.

2. LA MANIPOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI (Capitolo 1, 13, Brown T.A. 2007-Zanichelli, Bologna; Capitolo 6, Glick BR, Pasternak J.J. 2003-Zanichelli, Bologna).
Isolamento di un gene per PCR
L’espressione genica da promotori forti e regolabili
Le proteine di fusione
Ottimizzazione delle condizioni di espressione di proteine ricombinanti

3. LA PRODUZIONE DI PROTEINE RICOMBINANTI NELLE CELLULE EUCARIOTICHE
(Capitolo 13, Brown T.A. 2007-Zanichelli, Bologna; Capitoli: 7, 17 Glick BR, Pasternak J.J. 2003-Zanichelli, Bologna)
I sistemi di espressione per le cellule di mammifero. Sistemi di espressione stabile ed inducibile. Il sistema Tet off/Tet on.
I sistemi di espressione in Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris
I sistemi di espressione basati sulle cellule di insetto in coltura
I sistemi di espressione in cellule vegetali

4. LA MUTAGENESI MIRATA E LA MANIPOLAZIONE DELLE PROTEINE (Capitolo 8 Glick BR, Pasternak J.J. 2003-Zanichelli, Bologna)
I procedimenti per la mutagenesi mirata mediante il fago M13 e la PCR
La manipolazione delle proteine

5. BIOTECNOLOGIA MOLECOLARE (Glick BR, Pasternak J.J. 2003-Zanichelli, Bologna: Capitolo 9, pagg 183-186; Capitolo 10, pagg 213-218)
Gli anticorpi policlonali e monoclonali.
Gli anticorpi monoclonali come agenti terapeutici.

6. METODOLOGIE PER LO STUDIO DELL’ESPRESSIONE GENICA e DELL’INTERAZIONE PROTEINA-PROTEINA
(Capitolo 11, Brown T.A. 2007-Zanichelli, Bologna)
Tecniche per lo studio dell’espressione di un gene (RT-PCR, Northern blot, Western blot). PCR quantitativa e le sue applicazioni.
Tecniche per lo studio e per l’identificazione dei siti di inizio trascrizione (S1 nuclease, RNAse protection, Run-on e Run-off assays) ed origine di replicazione.
Tecniche per lo studio delle regioni regolatorie (promotori, enhancers)
Identificazione e studio funzionale delle proteine leganti il DNA con funzione regolatoria (DNaseI-footprinting, in vivo-footprinting, Electrophoretic Mobility Shift Assay, South Western, domain-swap, CHIP). Saggi ‘in vivo’ (Reporter assays).

Tecniche per lo studio dei networks di interazione proteina-proteina (GST-Pulldown, Co-immunoprecipitazione, Far-Western).
7. TEORIA SULLE TECNICHE PER IL SILENZIAMENTO DELL’ESPRESSIONE GENICA
Tecniche dell’anti-senso, dell’ anti-gene ed RNA-interference

8. UTILIZZO DI RADIOISOTOPI IN BIOLOGIA MOLECOLARE (fotocopie)
Manipolazione di Radioisotopi: tipi e utilizzo.
Tecniche per la marcatura di acidi nucleici e proteine.

Esperienze di laboratorio 

LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE.
Manipolazione di batteri competenti. Preparazione terreni e piastre per colture batteriche. Trasformazione batterica. Valutazione dell’efficienza di trasformazione. Preparazione di DNA plasmidico: Crescita, minipreps ed analisi di restrizione del DNA plasmidico su gel di agarosio.

LA MANIPOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI
Espressione e purificazione di proteine ricombinanti in E. coli. Messa a punto delle condizioni ottimali di espressione di una proteina di fusione e sua purificazione su resina di affinità. Calcolo dell’efficienza di espressione-purificazione. Utilizzo della proteina ricombinante purificata per saggi endonucleasici.

METODOLOGIE PER LO STUDIO DELLA ESPRESSIONE GENICA
Estrazione, purificazione e analisi di RNA e preparazione di cDNA
Dosaggio spettrofotometrico di primers di ssDNA (GAPDH e Ref-1) per PCR e analisi su gel denaturante.
Estrazione di RNA da colture cellulari di cellule eucariotiche (HepG2), retro trascrizione dei geni di interesse ed analisi dell’espressione genica mediante PCR. Analisi su gel di agarosio dell’amplificato di PCR. Estrazione e purificazione da gel di un amplificato di PCR.
Estrazione di proteine da cellule di mammifero e analisi di Western blotting di un gene espresso.
Estrazione di proteine nucleari e citoplasmatiche da colture cellulari di cellule eucariotiche (HepG2) e analisi dell’espressione di APE1/Ref-1 mediante Western blotting.

Bibliografia

• L. Allison “Fondamenti di Biologia molecolare” Zanichelli
• B. Alberts et al. “Biologia molecolare della cellula” Zanichelli
• J. Watson et al. “Biologia molecolare del gene” Zanichelli
• T.A. Brown “Genomi” EdiSES
• T.A. Brown 2007 “Biotecnologie molecolari”-Zanichelli, Bologna;
• Glick BR, Pasternak J.J. 2003 Biotecnologia Molecolare, -Zanichelli, Bologna;
• Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook and Russel, CSHL Press;
• Twyman R., Old B. Ingegneria Genetica, principi e tecniche, Primrose S., 2004- Zanichelli, Bologna
• Watson J.D., Caudy A.A., Myers R.M., Witkowski J.A., DNA ricombinante, Geni e genomi, 2008- Zanichelli, Bologna
• articoli e riferimenti specifici aggiornati indicati dal docente.

Modalità d'esame

Prova scritta con esercizi, prova pratica in laboratorio e prova orale. Le date di esame sono riportate su Esse3. E’ necessario prenotarsi per le prove di esame. I risultati degli esami saranno riportati, entro una settimana al massimo dalla prova, su Esse3.

Modalità di contatto con i docenti

I docenti sono sempre disponibili a ricevere gli studenti (Dipartimento di Scienze Mediche e Biologiche, Piazzale Kolbe 4, Udine). Per prendere appuntamento telefonare al 0432-494311 (Prof. Gianluca Tell) e allo 0432-494313 (Dott. Carlo Vascotto) o inviare email a gianluca.tell@uniud.it o a carlo.vascotto@uniud.it. La posta elettronica può essere usata anche per rivolgere direttamente domande o richieste di spiegazione ai docenti.