Docenti

Gennaro Esposito rino.esposito@uniud.itSabina Susmel sabina.susmel@uniud.it

Crediti

9 CFU

Finalità

Il modulo di Chimica fisica biologica intende fornire le basi generali della termodinamica fisica e chimico-fisica, insieme all’applicazione delle metodiche termodinamiche microcalorimetriche ai biopolimeri e loro complessi. Anche la cinetica di formazione di complessi verrà trattata esaminando gli aspetti energetici e la realizzazione di misure. Un secondo aspetto del modulo contemplerà l’interazione tra onde elettromagnetiche e materia per introdurre principi generali ed applicazioni spettrometriche biotecnologiche, quali le spettroscopie ottiche e la spettroscopia NMR in aggiunta alla spettrometria di massa.

Il modulo di Chimica analitica presenta metodi e tecniche analitiche opportunamente scelti per il loro carattere formativo per dare una base scientifica di partenza agli studenti iscritti a tale corso. Dopo i richiami alla teoria e ai metodi classici (equilibri in soluzione e titolazioni), saranno trattate le tecniche strumentali più moderne per applicazioni biotecnologiche, cioè la sensoristica, approfondendone gli aspetti tecnici, con dettagli di funzionamento e ottimizzazione, nonché esempi di uso in campo biomedico-clinico. Fra le tecniche strumentali tradizionali, saranno proposte le tecniche ottiche che sfruttano l’interazione fra radiazione elettromagnetica e materia (spettrofotometria molecolare di assorbimento e tecniche di emissione) sempre nel dettaglio degli aspetti tecnico-applicativi.

Programma

CHIMICA FISICA BIOLOGICA
Termodinamica: Sistemi e processi. Trasformazioni reversibili ed irreversibili. Passaggi di stato. Variabili di stato, equazione di stato. Stato di equilibrio. Stato stazionario. Gas ideali e reali. Teoria cinetica dei gas. Lavoro e calore. Capacità termica dei gas e dei solidi. Principio zero. Temperatura e scale termometriche. 1° principio. Energia interna. Lavoro e calore in processi reversibili ed irreversibili. Processi isocori ed isobarici. Entalpia, legge di Hess. Il potenziale termodinamico. L’entropia ed il 2° principio. Significato statistico dell’entropia. Trasformazioni ed energia libera di Gibbs e di Helmoltz. Potenziale chimico. Stati di riferimento. Criteri di spontaneità di un processo. L’equilibrio, la costante di equilibrio e G0. Cenni di elettrochimica. Transizioni di fase e capacità termica.

Fenomeni ondulatori: Onde elettromagnetiche. Polarizzazione. Richiami su spettro elettromagnetico, interazione radiazione materia e principali spettroscopie ottiche. Applicazioni a biopolimeri di dicroismo circolare, UV e fluorescenza.

Microcalorimetria: Diagramma di stato e transizioni di fase. DSC, ITC e applicazioni biotecnologiche. Entalpia, entropia ed energia libera di Gibbs e loro variazione con la temperatura. Entalpia calorimetrica e secondo van’t Hoff. Elaborazione di termogrammi. Microcalorimetria di proteine, acidi nucleici e biomolecole. Procedure ed apparati sperimentali. Applicazioni per studi biofisici. Studio di stabilità termica di proteine (unfolding e refolding). Studi di interazione biomolecole-ligandi. Competizione di legame tra stato nativo e denaturato. Effetti di pH e forza ionica. Interazioni con ioni metallici.

Termodinamica di biopolimeri: Misura della stabilità conformazionale di proteine. Selezione e criteri di scelta delle tecniche di misura. Generalità sull’applicazione di tecniche spettroscopiche e non. Denaturazione termica e con agenti chimici. Elaborazione dei dati sperimentali. Equilibrio e reversibilità. Procedure sperimentali per studi di denaturazione. Esercitazioni pratiche.

Cinetica: Estensione di concetti termodinamici e teoria dello stato di transizione.Cinetica di reazione ed equazione empirica di Arrehnius. Energia di attivazione e velocità assoluta. Equazione di Eyring. Energia ed entalpia di attivazione e corrispondenti termodinamici. Cinetica di reazione e reazioni endotermiche e di denaturazione di biopolimeri.

Spettrometria di massa: Richiami teorici di elettromagnetismo. Campi di applicazione della spettrometria di massa. Applicazioni di interesse biotecnologico. Massa molecolare, definizione ed accuratezza. Massa molecolare nominale, media e monoisotopica. Distribuzione isotopica naturale e utilizzazione in spettrometria di massa. Lo spettrometro di massa. Iniezione diretta, per via cromatografica e per via elettroforetica. Metodi di ionizzazione. Metodi di ionizzazione soft. Analizzatori a settore magnetico o quadrupolo, analizzatore TOF, analizzatore a risonanza ciclotronica. Strumenti a doppio o multiplo analizzatore e spettrometria di massa tandem o massa-massa. L’importanza delle metodiche di ionizzazione soft in analisi di biopolimeri. Ionizzazione elettrospray. Tecnica nanospray. Dettagli su ionizzazione MALDI. Lo spettrometro MALDI-TOF. Metodi di analisi massa-massa. Scansione di ioni prodotto o precursore. Scansione a perdita neutra costante. Sequenziamento peptidico. Identificazione di proteine. Proteomica. Risoluzione in spettrometria di massa.

Applicazioni a biopolimeri per determinazioni strutturali e funzionali della spettrometria di massa: Spettrometria di massa in proteomica e metabonomica. Analisi di mappe 2D e proteomica quantitativa. Metodi alternativi. ICAT e MCAT. Prefrazionamento elettroforetico o cromatografico. Protein Chip. Determinazione di modificazioni posttraduzionali mediante spettrometria di massa. Applicazioni analitiche biomediche.

Spettroscopia NMR: Generalità sul magnetismo. Correnti in spire e momento di dipolo magnetico. Interazione momento-campo magnetico. Forza di Lorentz. Nuclei e momento magnetico di spin nucleare. Descrizione classica. Precessione ed equazione di Larmor. Rapporto giromagnetico. Descrizione quantomeccanica. Quantizzazione del momento angolare di spin nucleare e del momento di dipolo magnetico nucleare. Transizioni e regole di selezione. Magnetizzazione macroscopica longitudinale e trasversale. Eccitazione NMR e impulsi di radiofrequenza. Sistema di riferimento rotante e di laboratorio. Coerenza di fase e segnale NMR. Campionamento di segnale e trasformata di Fourier. Equazioni di Bloch e costanti di rilassamento T1 e T2. FID. Intensità del segnale NMR. Chemical shift e natura chimica. Chemical shift di biopolimeri. Chemical shift limite e contributi di struttura secondaria e terziaria. Chemical Shift Index. Accoppiamento scalare. Molteplicità ed accoppiamento scalare. Accoppiamento scalare forte. Accoppiamento dipolare. Chemical shift isotropo e MAS. Scambio chimico. Regimi di scambio ed effetti su chemical shift e costanti di accoppiamento scalare. Rilassamento longitudinale e trasversale. Misura di T1 e T2. Mobilità molecolare e rilassamento. Funzione di autocorrelazione e densità spettrale. Effetto Overhauser nucleare (NOE) e sua misura. NOE, mobilità molecolare e struttura spaziale. NOE eteronucleare.

Applicazioni a biopolimeri per determinazioni strutturali e funzionali della spettroscopia NMR : Spettroscopia NMR multidimesionale. Campionamento discreto e frequenza di campionamento. Acquisizione discreta indiretta nella seconda dimensione. Trasformata in due dimensioni. Spettri 2D omonucleari ed eteronucleari. Concetto di correlazione o connettività. Correlazioni scalari e dipolari. Spettri di tipo COSY. Pattern COSY di amminoacidi e nucleotidi ed identificazione dei sistemi di spin. COSY con filtri quantici multipli. TOCSY. Struttura fine di cross-peak . Correlazioni dipolari e spettri NOESY. Assegnazione sequenziale. Correlazioni dipolari e struttura molecolare. Riconoscimento di struttura secondaria di proteine. Struttura secondaria ed assegnazione sequenziale.

Scambio isotopico: Applicazioni classiche dello scambio isotopico a proteine. Meccanismi di scambio isotopico per polipeptidi. Catalisi acida e basica. La costante di scambio complessiva, kex. Valori tipici di kex. Dipendenza dalla temperatura. Dipendenza dal pH. Effetti della sequenza sulle velocità di scambio. Contributo di struttura secondaria e terzaria. Fattore di protezione. Scambio in polipeptidi destrutturati. Scambio in polipeptidi strutturati. Meccanismo dell’apertura locale. Regimi limite di scambio EX1 e EX2. Processi di scambio correlate e non. Costanti fenomenologiche di scambio e stabilità termodinamica locale. Misure di scambio isotopico. Incorporazione di 3H. Metodo IR. Massa ridotta e frequenze di assorbimento IR. La banda ammide II. Metodi di spettrometria di massa. Scambio isotopico e frammentazione proteolitica. Tarature e retroscambio. Distribuzione di pattern isotopici. Condizioni di misura e distribuzioni bimodali. Misure di scambio isotopico mediante NMR. Applicazioni per studi funzionali.

CHIMICA ANALITICA
Equilibri in soluzione
Definizioni di acido e base. Coppie coniugate ed equilibrio di autoprotolisi dell’acqua. Definizione di pKa e suo significato. Definizione di pH. Diagramma di Flood. Titolazioni acido-base. Metodi di individuazione del punto equivalente. Indicatori. Soluzioni tampone ed equazione di Henderson.
Equilibri redox: definizioni; Equazione di Nernst, Introduzione alle celle elettrochimiche: misure potenziometriche ed amperometriche, struttura e funzionamento delle celle, tipologie di elettrodi (indicatore, lavorante, ausiliario ed elettrodi di riferimento) e loro funzionamento.

Spettrofotometria di assorbimento molecolare
Radiazione elettromagnetica definizioni; effetti dell’interazione radiazione-materia; caratteri distintivi fondamentali fra tecniche di assorbimento e di emissione (luminescenza: fosforescenza e fluorescenza); Trasmittanza e Legge di Beer; Strumentazione per misure di assorbimento: descrizione dettagliata dello strumento e del funzionamento delle varie parti costitutive; Strumentazione per misure di emissione; Misure quantiative (sensibilità, accuratezza, precisione, rette di taratura metodo della aggiunta tarata); misure qualitative presentate rispetto a misure nel campo spettrale IR; cenni su strumentazione e misure IR.
Tecnica SPR (Surface Plasmon Resonance)

Sensori
Definizione; strategie di ottimizzazione: modifica della superficie con metodi chimici e fisici; natura dei modificatori: chimici e biologici (biosensori) esempi; Trasduttori definizione, funzionamento, principio della misura e classificazione dei sensori; Vengono approfonditi nel dettaglio costruttivo e di funzionamento i seguenti sensori: a fibra ottica, termoelettrici, piezoelettrici, potenziometrici iono-selettivi, iono-selettivi a cristallo solido, a membrana liquida, compositi, amperometrici (tecniche di misura presentate amperometria e voltammetria lineare o ciclica), biosensori enzimatici ed immunosensori. Tutti i sensori proposti vengono corredati con esempi di applicazioni di interesse biotecnologico evidenziando il tipo di informazione (qualitativa, quantitativa) che il loro uso consente di ottenere.

Propedeuticità consigliate

Formazione di base in Fisica Generale, Chimica Generale (inorganica ed organica), Analisi Matematica.

Bibliografia

CHIMICA FISICA BIOLOGICA
Testo consigliato: P.W. ATKINS, J. DE PAULA - ELEMENTI DI CHIMICA FISICA - Terza edizione italiana - ISBN 978-8808-1-9285-1
Materiale didattico on-line
CHIMICA ANALITICA
G.D. Christian and J.E. O'Relley, Instrumental analysis, Allyn and Bacon, Boston, 1986.
F.W. Fifield and D. Kealey, Chimica Analitica; Teoria e pratica, Zanichelli, Bologna, 1999.
Eggins, Brian R., Chemical Sensors and Biosensors, Analytical Techniques in the Sciences, John Wiley & Sons, 2002.

Modalità d'esame

Compito scritto con problemi e domande a scelta multipla