INFORMAZIONI SU

Biochimica I

Programma dell'insegnamento - Corso di laurea in Biotecnologie

Docente

prof. Irene Mavelliirene.mavelli@uniud.it)

prof. Marina Comelli (marina.comelli@uniud.it)

prof. Alessia Buso

Crediti

7 CFU

Obiettivi formativi specifici

L’obiettivo del Corso è di far acquisire allo studente le nozioni fondamentali della BIOCHIMICA GENERALE STRUTTURALE. Parti fondamentali del corso sono struttura e funzione delle proteine; correlazione struttura-funzione e interazioni proteina-ligando; proteine, lipidi e carboidrati di membrana; membrane e trasporto. Tali nozioni sono necessarie per la comprensione delle innumerevoli applicazioni biotecnologiche delle proteine e dei meccanismi molecolari alla base dei processi vitali della cellula.
Il Corso è teorico–pratico ed ha anche lo scopo di far acquisire allo studente le abilità di base indispensabili per affrontare un esperimento di Biochimica e alcune nozioni e competenze fondamentali delle METODOLOGIE BIOCHIMICHE, con particolare riguardo alle strategie per l’isolamento e la purificazione di proteine, nonchè alle tecniche analitiche per il monitoraggio della purificazione. Vengono fornite le basi teoriche di metodologie e tecniche di uso corrente, che sono anche oggetto di esercitazioni di laboratorio, nonché informazioni relative a possibili applicazioni e sviluppi avanzati di queste.
Il corso è finalizzato pertanto all’acquisizione sia di conoscenze teoriche sia di competenze pratiche, dando modo allo studente di applicare in laboratorio alcune nozioni acquisite durante le lezioni. Ogni esperienza di laboratorio è preceduta da un’introduzione che illustra sia il problema sperimentale da affrontare e l'obiettivo da perseguire, sia gli strumenti e i reagenti da usare. Ogni esperienza inoltre è seguita dalla discussione dei dati ottenuti.

Competenze acquisite

- Conoscenza approfondita sui livelli di organizzazione strutturale delle proteine e sulla relazione struttura/funzione.

- Conoscenza dei concetti di base e delle proprietà chimico-fisiche della proteina di interesse indispensabili per disegnare le diverse tappe di una buona strategia di purificazione.

- Conoscenza dei principi teorici di procedure e tecniche in uso per la purificazione di proteine

- Conoscenza delle proprietà funzionali delle proteine con particolare riguardo all’interazione proteina-ligando

- Conoscenza dei componenti e delle proprietà strutturali e funzionali delle membrane biologiche con particolare riguardo alle proteine di membrana

- Competenze per effettuare la determinazione quantitativa della concentrazione di proteine pure in soluzione o di miscele complesse di proteine. standardizzazione del saggio (costruzione del grafico di taratura utilizzando albumina come proteina standard e verifica dell’intervallo di linearità), valutazione dell’errore analitico e della precisione del saggio. Confronto tra metodi diversi in termini di intervallo di applicazione, sensibilità e accuratezza.

- Competenze per effettuare una cromatografia su colonna per gel filtrazione e a scambio ionico.

- Competenze per effettuare una elettroforesi di proteine su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti (SDS-PAGE) sia per la determinazione della massa molecolare e della struttura quaternaria di una proteina, sia come criterio di omogeneità e di purezza nel corso di un processo di purificazione.

Programma

DESCRIZIONE DELLA  ORGANIZZAZIONE DEL CORSO, INTRODUZIONE ALLE PROTEINE. GLI AMMINOACIDI STANDARD

Organizzazione del corso e modalità d'esame. Contenuti del corso e relazioni con quelli dei corsi affini di Biochimica 2. Biologia molecolare, Biologia cellulare. Chimica analitica. Una rassegna generale delle proprietà e dell'importanza biologica delle proteine. Proteine semplici e proteine coniugate. La componente non polipeptidica nelle proteine coniugate: metalli, gruppi prostetici e cofattori. Ruolo funzionale e ruolo strutturale di tale componente. Amminocidi standard: proprietà generali. Proprietà acido-base e pH isoelettrico. Titolazione di un amminoacido; la glicina.

LE CATENE LATERALI DEGLI AMMINOACIDI STANDARD

Proprietà strutturali e chimiche delle catene laterali degli amminoacidi standard. Rilevanza per l'organizzazione strutturale delle proteine. I pK delle catene laterali. Titolazione di amminoacidi acidi e basici. La peculiarità dell’istidina.

IL LEGAME PEPTIDICO - OLIGOPEPTIDI E PEPTIDI BIOATTIVI

Le caratteristiche strutturali del gruppo peptidico e i vincoli al ripiegamento delle catene polipeptidiche. Le reazioni di formazione e di idrolisi del legame peptidico: aspetti cinetici e termodinamici. Oligopeptidi e Peptidi. Alcuni esempi con il rispettivo ruolo biologico e la rilevanza farmacologica e tossicologica: glutatione, antibiotici, tossine, ormoni a struttura peptidica.

I POLIPEPTIDI E LE PROPRIETA' GENERALI DELLE PROTEINE

Alcuni esempi di polipeptidi con il rispettivo ruolo biologico e rilevanza farmacologica. La composizione delle proteine alla base delle loro proprietà generali. PROPRIETA’ ACIDO-BASE: L’effetto della catena polipeptidica sui pK delle catene laterali dei residui aa. Gli accettori e i donatori di protoni; La catalisi acido-base nel meccanismo di azione di enzimi. Il pH isoelettrico delle proteine e le curve di titolazione delle proteine. PROPRIETA’ SPETTROSCOPICHE alla base dei metodi spettroscopici per lo studio delle proteine. I principi alla base dell’organizzazione strutturale e il concetto di conformazione delle proteine

LE PROPRIETA' STRUTTURALI DELLE PROTEINE-LA STRUTTURA PRIMARIA

Composizione e sequenza amminoacidica. Significato e specificità della sequenza di una proteina. I precursori e i tagli proteolitici delle proteine nascenti: l’esempio dell'insulina. Importanza della determinazione in laboratorio della sequenza di una proteina. Confronto di sequenze di proteine. Allineamento di sequenze di proteine: cenni su metodi per ottimizzare il numero di sovrapposizioni. Le banche dati di sequenza. Dal confronto delle sequenze di proteine omologhe si ottengono informazioni sulla loro struttura e funzione. I moduli proteici. Librerie peptidiche combinatorie per lo sviluppo di nuovi farmaci e per lo studio della funzione delle proteine.

LA STRUTTURA SECONDARIA

Le strutture a elica alfa, a foglietto beta e i ripiegamenti della catena. Gli amminoacidi che favoriscono e sfavoriscono le diverse strutture. I parametri strutturali e l'importanza funzionale. I diversi tipi di modelli strutturali.

LA STRUTTUTA TERZIARIA

Concetti generali: la struttura tridimensionale delle proteine e la stabilità delle proteine. Forma e struttura tridimensionale delle proteine. I fattori termodinamici che determinano la stabilità delle proteine. Denaturazione e rinaturazione. La conformazione nativa e la funzione biochimica. La struttura terziaria delle proteine globulari in ambiente acquoso e in ambiente idrofobico.

STRUTTURE TERZIARIE ESEMPLIFICATIVE DI PROTEINE GLOBULARI-DETERMINAZIONE E ANALISI DELLA STRUTTURA TERZIARIA

Le strutture esemplificative di mioglobina, citocromo c, lisozima e ribonucleasi. Il nucleo idrofobico. Il contributo alla stabilità della struttura del legame di gruppi prostetici e dei ponti disolfuri. I domini proteici. Determinazione sperimentale della struttura terziaria delle proteine globulari: vantaggi e svantaggi della Cristallografia ai raggi x e della Risonanza magnetica nucleare. Analisi in silico della struttura terziaria delle proteine globulari. Le banche dati. Le strutture super-secondarie o ripiegamenti stabili.

STRUTTURA QUATERNARIA DI PROTEINE GLOBULARI

La struttura quaternaria delle proteine globulari. Le subunità di proteine oligomeriche. Le interfacce di interazione proteina-proteina e i contributi alla stabilità. Cenni sul ruolo dell’'interazione proteina-proteina nella regolazione metabolica e nella bio-segnalazione. Determinazione sperimentale della massa molecolare e della struttura quaternaria delle proteine. Rinvio a esercitazioni e laboratori per le tecniche di base (SDS-PAGE, Cromatografia liquida per esclusione molecolare) e cenni su tecniche sofisticate (ultracentrifugazione analitica, spettrometria di massa).

LA STRUTTURA DELLE PROTEINE FIBRILLARI E FIBROSE

La struttura terziaria delle proteine fibrillari. Le proteine fibrose insolubili in acqua: alfa cheratina. fibroina e collageno. La struttura quaternaria e le associazioni sovra-molecolari. Le proteine fibrillari solubili in acqua. La struttura ad avvolgimento avvolto nella miosina: il nucleo dell’unità contrattile nel muscolo.

PURIFICAZIONE DI PROTEINE

Concetti di base e principi generali per una buona strategia di purificazione L’importanza della purificazione di proteine per lo studio di struttura e funzione. Le applicazioni in ambito biotecnologico. Le proprietà della proteina di interesse la cui conoscenza rappresenta un requisito indispensabile per il disegno di una buona strategia di purificazione. Criteri di scelta fra diverse possibili strategie di purificazione.

PURIFICAZIONE PROTEINE : esercitazione

Le diverse fasi di una strategia di purificazione e le procedure per ridurre il numero di passaggi

FASE 1: Sviluppo di un metodo di saggio adeguato. I diversi saggi e le caratteristiche ottimali.

FASE 2: Selezione del materiale di partenza migliore. Le fonti naturali e le cellule in coltura eucariotiche, procariotiche e ingegnerizzate..

FASE 3: Estrazione e solubilizzazione della proteina desiderata e sviluppo dei passaggi di purificazione.

- Disintegrazione cellulare e Omogeneizzazione: differenze per tessuti animali, tessuti vegetali, microorganismi. Chiarificazione dell’estratto.

- Frazionamento subcellulare.

- Isolamento della proteina di interesse per solubilità differenziale o Precipitazione frazionata.

- passaggi di vera e propria purificazione mediante separazione cromatografica eseguiti secondo una logica nella sequenza .

FASE 4: Concentrazione, conservazione del campione.

TECNICHE CENTRIFUGATIVE : esercitazione

Tipi di centrifughe e tipi di rotori disponibili. L'uso della centrifuga. La relazione tra campo gravitazionale G e velocità del rotore in r.p.m. Tabelle di conversione. Velocità di sedimentazione v e coefficiente di sedimentazione s. Norme di sicurezza per l’uso di una centrifuga. Come usare una centrifuga da banco a bassa velocità.

CROMATOGRAFIA:  PRINCIPI GENERALI E PROCEDURE esercitazione

Scopo della cromatografia. I componenti essenziali di un sistema cromatografico . Il principio generale della separazione cromatografica. Tipi di sistemi cromatografici. La cromatografia su strato sottile TLC. Procedura per la cromatografia su colonna. Il concetto di piatto cromatografico. Le caratteristiche del cromatogramma. Tipi di matrici utilizzate. Cromatografia liquida per esclusione molecolare (gel-filtrazione). Separazione proteine di massa molecolare diversa (procedura approfondita nei laboratori). Applicazione per la determinazione sperimentale della massa molecolare e della struttura quaternaria delle proteine. Cromatografia a scambio ionico (procedura approfondita nei laboratori).. Cromatografia di affinità Cromatografia di adsorbimento. Interazioni idrofiliche o idrofobiche. Cromatografia di ripartizione. Rivelazione e analisi. Ottimizzazione delle separazioni cromatografiche e interpretazione dei cromatogrammi. Analisi quantitativa: standardizzazione esterna e standardizzazione interna.
Cromatografia liquida ad alta risoluzione. HPLC e FPLC, tipi di rivelatori, applicazioni avanzate: micro e nanoHPLC.

LE PROPRIETA' FUNZIONALI DELLE PROTEINE

Interazioni proteina-ligando e dinamica della struttura proteica. L’analisi cinetica dell’interazione.

MIOGLOBINA

Le proprietà funzionali della mioglobina.

EMOGLOBINA

Le proprietà strutturali e funzionali dell'emoglobina. Il legame cooperativo di un ligando a una proteina multimerica. L'allosterismo: un fenomeno di interesse generale. L'emoglobina come esempio di proteina allosterica. I ligandi modulatori del legame dell'ossigeno. L'anemia falciforme come esempio di malattia molecolare.

MEMBRANE BIOLOGICHE E TRASPORTO DI SOLUTI 1: Proprietà generali e chimiche dei lipidi di membrana; composizione lipidica e organizzazione strutturale Aspetti generali sulle membrane biologiche. Proprietà generali dei lipidi di membrana. Glicerofosfolipidi e sfingolipidi. La composizione lipidica è una caratteristica delle diverse membrane. Un doppio strato lipidico è un elemento strutturale delle membrane stabilizzato da aumento di entropia. Possibili aggregati di lipidi anfipatici in acqua; applicazione alle biotecnologie e alle nanotecnologe. L'architettura sovramolecolare delle membrane biologiche.

MEMBRANE BIOLOGICHE E TRASPORTO DI SOLUTI 2: Le proteine di membrana.

La composizione proteica delle membrane provenienti da fonti diverse varia più della composizione lipidica e riflette una specializzazione funzionale delle membrane. Le proteine di membrana e il loro rapporto con i lipidi. Le strutture secondarie delle porzioni transmembrana. Gli approcci sperimentali per lo studio della struttura delle proteine integrali. Esempi: l'organizzazione molecolare della glicoforina, la batteriorodopsina. Le glicoproteine e i glicidi di membrana .

MEMBRANE BIOLOGICHE E TRASPORTO DI SOLUTI 3  Il trasporto di soluti attraverso le membrane

Le proteine con funzione di trasporto: canali transmembrana, trasportatori e pompe. La diffusione semplice. Il trasporto passivo facilitato da proteine transmembrana, Il trasposto attivo. Il sistema di classificazione dei trasportatori (TC system) con alcuni esempi utili per desumerne concetti di interesse generale. Le porine. Il trasportatore del glucosio degli eritrociti (GluT1) come esempio di trasportatori della Classe 2. L’analisi cinetica del trasporto di glucosio è analoga alla cinetica di reazione catalizzata da un enzima. Lo scambiatore cloruro-bicarbonato della membrana dell'eritrocita. I quattro tipi di ATPasi di trasporto.

ELETTROFORESI DELLE PROTEINE PRINCIPI E PROCEDURE 1 esercitazione

Principi generali. I fattori che influenzano la mobilità elettroforetica: Forza elettrica/elettrostatica e Forza frizionale. Accorgimenti pratici: scelta del pH e del mezzo di supporto poroso. Dissipazione del calore: requisito per l’efficacia della separazione. Flusso elettro-osmotico (EOF) o elettroendosmosi. Il gel di poliacrilamide e l'effetto setaccio molecolare. Gel in gradiente di poliacrilamide. Rivelazione e analisi delle bande, stima quantitativa e recupero della proteina da gel. Registrazione e quantificazione dei risultati.

ELETTROFORESI DELLE PROTEINE APPLICAZIONI esercitazione

Applicazioni. Criterio di purezza (omogeneità) e monitoraggio delle diverse fasi della purificazione; Analisi di miscele complesse di proteine; Purificazione (con apparati preparativi); Diagnosi e ricerca clinica (profilo proteico fluidi biologici). SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis): Principi e accorgimenti pratici. Determinazione sperimentale della massa molecolare apparente e della struttura quaternaria delle proteine (procedura approfondita nei laboratori).

TECNICHE ELETTROFORETICHE AVANZATE

Elettroforesi capillare. Focalizzazione isoelettrica, Elettroforesi bidimensionale. Elettroforesi ad alta risoluzione.

Laboratorio

Preparazione di reagenti e soluzioni tampone per i laboratori programmati. Pesate e diluizioni.

Determinazione della concentrazione di una proteina in soluzione mediante misura dell'Assorbanza nell'UV. Costruzione della retta di taratura e verifica della linearità.

Isolamento di mitocondri da cellule in coltura. Raccolta e sospensione delle cellule nel mezzo di omogeneizzazione. Omogeneizzazione mediante sonicazione. Centrifugazione differenziale. Congelamento e conservazione della frazione mitocondriale grezza. Valutazione del volume iniziale della sospensione cellulare e di quello finale delle frazioni ottenute per il calcolo della resa.

Dosaggio con il metodo di Lowry della concentrazione di proteine della preparazione di mitocondri grezzi e delle frazioni ottenute nel laboratorio precedente. Preparazione di soluzioni standard di BSA per la retta di taratura. Preparazione dei campioni. Sviluppo del saggio colorimetrico: derivatizzazione dei campioni per la formazione del cromogeno. Applicazione della legge di Lambert-Beer per il calcolo della concentrazione. Calcolo della resa di proteine mitocondriali rispetto alla concentrazione proteica dell'omogenato cellulare di partenza.

Determinazione quantitativa della concentrazione di lisozima in preparazioni (commerciali o ottenute in laboratorio) mediante il metodo dell’acido bicinconinico (BCA). Preparazione di soluzioni standard di BSA per la retta di taratura. Preparazione dei campioni. Sviluppo del saggio colorimetrico. Calcolo della concentrazione.

Confronto tra i saggi eseguiti per la determinazione quantitativa della concentrazione di proteine in soluzione: intervallo di applicazione, vantaggi e svantaggi, interferenze.

Cromatografia liquida per gel-filtrazione. Allestimento di colonne cromatografiche utilizzando resine Sephadex G25 fine o corse, o Sephadex G50. Caricamento della miscela da separare (proteine e composti a basso peso molecolare) sulle colonne e sviluppo della cromatografia. Monitoraggio dell'eluizione mediante lettura dell'assorbanza a 280nm. Costruzione e analisi del cromatogramma

Dialisi di una miscela di proteine e composti a basso peso molecolare (es,: Emoglobina e Vit. B12).

Isolamento di una proteina da materiale biologico (es.: lisozima dall'albume di uovo) e purificazione mediante cromatografia a scambio ionico. Allestimento della colonna (es.: cellulosa fosfato in tampone 25mM glicina, pH 9.2) e sviluppo della cromatografia. Eluizione mediante gradiente salino (NaCl). Monitoraggio dell'eluizione mediante saggio colorimetrico Bradford.

Preparazione di campioni (frazioni dell’eluato e satard di riferimento) per elettroforesi in condizioni denaturante (SDS-PAGE): bollitura in presenza di SDS e 5mM beta-mercaptoetanolo. Conservazione dei capioni.

SDS-PAGE di campioni proteici applicata a:

1) Monitoraggio di una purificazione di una proteina,

2) Determinazione del Peso Molecolare di proteine pure.

Si utilizzano gel di poliacrilammide forniti dal docente e campioni proteici preparati nel laboratorio precedente (es.: aliquote della preparazione di lisozima) o forniti dal docente. Vengono eseguiti il caricamento dei campioni su gel, la corsa elettroforetica, la colorazione e la decolorazione dei gel. Si effettua anche l’analisi dei gel ottenuti: visualizzazione delle bande e analisi del profilo densitometrico. Viene determinato il Peso molecolare delle componenti proteiche visualizzate con riferimento agli standard di peso molecolare mediante costruzione del grafico semilogaritmico.


 

Totale ore lezioni ed esercitazioni

53

di cui di esercitazioni

13

Ulteriori attività di didattica assistita

Ore

Totale ore dedicate ad altre attività di didattica assistita

32

Totale ore complessive

85

Bibliografia

I principi di Biochimica di Lehninger. D.L. Nelson & M.M. Cox (ed. Zanichelli)

Biochimica. J.N. Berg , J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L. Stryer (ed. Zanichelli).
Metodologie di Base per la Biochimica e la Biotecnologia, Ninfa-Ballou (ed. Zanichelli)

METODOLOGIE BIOCHIMICHE Principi e tecniche per l’espressione, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo 2012 (ed. Zanichelli CEA)

I testi indicati sono consigliati come possibili alternative sia per la Biochimica strutturale che per le Metodologie biochimiche, sono tuttavia disponibili in commercio numerosi altri testi aggiornati e validi.
Per la parte di Laboratorio vengono anche forniti agli studenti i protocolli degli esperimenti, alcuni manuali per l’uso di strumenti e dispense di approfondimento relative alle tecniche applicate in laboratorio

Modalità d'esame

L’esame consiste in una prova scritta, finalizzata a verificare le conoscenze teoriche e le competenze pratiche-sperimentali acquisite. La prova consiste in domande a risposta aperta breve e/o a scelta multipla, nonché nella soluzione di esercizi e problemi in relazione alla parte sperimentale affrontata durante i laboratori.
Contribuiscono alla valutazione complessiva anche le relazioni scritte (rapporti tecnici) di ogni esperienza di laboratorio che gli studenti durante il corso sono tenuti a redigere, rispondendo ad eventuali quesiti formulati dal docente.

 

Propedeuticità

Chimica e Fisica generali, Chimica Organica.

Modalità di contatto con i docenti

La docente (Prof.ssa Irene Mavelli) è disponibile a ricevere gli studenti in qualsiasi giorno previo appuntamento (Dipartimento di Scienze Mediche e Biologiche, Piazzale Kolbe 4, Udine). Per prendere appuntamento telefonare al 0432-494350 o inviare e-mail a irene.mavelli@uniud.it. La posta elettronica può essere usata anche per rivolgere direttamente quesiti o richieste di spiegazione.