Docente

Prof. Gianluca Tell (gianluca.tell@uniud.it)

Crediti

7 CFU, 70 ore di didattica frontale

Distribuzione del Corso: insegnamento semestrale

Obiettivi formativi specifici

Comprensione del rapporto tra struttura ed attività nelle macromolecole di interesse biologico. Comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della trasmissione, espressione ed evoluzione dei caratteri ereditari della cellula e del mantenimento della stabilità genomica. Fare acquisire allo studente le competenze per la comprensione dei meccanismi con cui viene regolata l’espressione dei geni nei procarioti e negli eucarioti, in relazione a processi quali la proliferazione ed il differenziamento cellulare, nello sviluppo embrionale e nella maturazione anticorpale, e delle modalità per inibire selettivamente l’espressione genica nonchè il ruolo di molecole di RNA non-codificante.

È articolato in lezioni frontali (Modulo I) affiancate ad esperienze di laboratorio (Modulo II), in cui lo studente ha modo di applicare le nozioni circa le metodologie base utilizzate nell’ambito della Biologia Molecolare quali: le tecnologie del DNA ricombinante (plasmidi e loro analisi, purificazione e manipolazione, le strategie di clonaggio di un gene, librerie genomiche e di espressione), la manipolazione dell’espressione genica nei procarioti e la mutagenesi mirata, l’espressione di proteine ricombinanti in procarioti ed eucarioti, le metodologie per l’analisi di espressione genica (RNA e proteine) e dell’interazione proteina-proteina, le tecniche per il silenziamento genico. Ogni esperienza di laboratorio è preceduta da un’introduzione che illustra sia l'obiettivo da perseguire e l’abilità da acquisire, sia gli strumenti e i reagenti da usare. Ogni esperienza inoltre è seguita dalla discussione dei dati ottenuti.

Prerequisiti

Gli studenti devono aver seguito i corsi di Chimica Generale, di Chimica Organica, Fisica, Biochimica.

Obiettivi formativi del Corso - Programma generale del Corso

Comprensione del rapporto tra struttura ed attività nelle macromolecole di interesse biologico. Comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della trasmissione, espressione ed evoluzione dei caratteri ereditari della cellula e del mantenimento della stabilità genomica.

Fare acquisire allo studente le competenze per la comprensione dei meccanismi con cui viene regolata l’espressione dei geni nei procarioti e negli eucarioti, in relazione a processi quali la proliferazione ed il differenziamento cellulare, nello sviluppo embrionale e nella maturazione anticorpale, e delle modalità per inibire selettivamente l’espressione genica nonchè il ruolo di molecole di RNA non-codificante.

È articolato in lezioni frontali (Modulo I) affiancate ad esperienze di laboratorio (Modulo II), in cui lo studente ha modo di applicare le nozioni circa le metodologie base utilizzate nell’ambito della Biologia Molecolare quali: le tecnologie del DNA ricombinante (plasmidi e loro analisi, purificazione e manipolazione, le strategie di clonaggio di un gene, librerie genomiche e di espressione), la manipolazione dell’espressione genica nei procarioti e la mutagenesi mirata, l’espressione di proteine ricombinanti in procarioti ed eucarioti, le metodologie per l’analisi di espressione genica (RNA e proteine) e dell’interazione proteina-proteina, le tecniche per il silenziamento genico. Ogni esperienza di laboratorio è preceduta da un’introduzione che illustra sia l'obiettivo da perseguire e l’abilità da acquisire, sia gli strumenti e i reagenti da usare. Ogni esperienza inoltre è seguita dalla discussione dei dati ottenuti.

Programma dettagliato del Corso - Parte teorica (7 CFU, 70 ore)

1. Struttura primaria, secondaria e terziaria degli acidi nucleici. La struttura B del DNA. Le altre strutture ordinate stabili del DNA. Come la sequenza delle basi e le condizioni ambientali (pH, forza ionica, composizione solvente, temperatura) influenzano la stabilità delle strutture ordinate. I vari modi con cui si denatura il DNA. La denaturazione termica. Rinaturazione e ibridazione. La termodinamica e la cinetica dell’ibridazione. L’interazione DNA-proteine. Come alcune proteine leggono la sequenza delle basi. Le proprietà topologiche dei DNA chiusi. Il meccanismo di azione delle topoisomerasi. Metodi di sequenziamento del DNA. Metodi automatici di sequenziamento. L’amplificazione del DNA: la PCR. Gli enzimi di modificazione del DNA: endonucleasi, esonucleasi, le chinasi, le fosfatasi, le ligasi. Principi base sulle tecnologie del DNA ricombinante. Vettori per il clonaggio di geni. Plasmidi e batteriofagi. Purificazione e manipolazione di DNA plasmidico. Gli enzimi di restrizione e di modificazione, caratteristiche, tipi e modalità di funzionamento. La struttura secondaria degli RNA. Le ribonucleasi specifiche ed aspecifiche. Metodi sperimentali per la separazione degli acidi nucleici: l’elettroforesi su gel e la centrifugazione. La struttura dei cromosomi. Il genoma dei procarioti e degli eucarioti. Il genoma umano. Il genoma mitocondriale. La cromatina. Gli istoni. I nucleosomi. Replicazione del DNA. Le proprietà delle DNA polimerasi procariotiche ed eucariotiche. Inizio della replicazione e componenti dell’apparato di replicazione. Fedeltà della replicazione. Il meccanismo molecolare della replicazione. Regolazione dell’inizio della replicazione in Procarioti (Proteine DnaA e SeqA, ruolo di Dam e della metilazione di GATC) ed in eucarioti (il complesso di preinizio pre-RC e ruolo delle cicline). Terminazione della replicazione. I telomeri e le telomerasi.
2. Lesioni e riparazione del DNA. I meccanismi molecolari dei vari tipi di riparazione nei procarioti e negli eucarioti (MMR, BER, NER, NHEJ, Ricombinazione). Riparazione post-replicazione. La riparazione associata alla trascrizione.
3. La trascrizione. RNA polimerasi procariotiche ed eucariotiche. Il meccanismo di inizio della trascrizione nei procarioti e negli eucarioti. I fattori di trascrizione. Attivatori e repressori della trascrizione. I promotori, i potenziatori (enhancers), il mediatore negli eucarioti. La regolazione della trascrizione nei procarioti (gli operoni) e negli eucarioti. Gli ormoni peptidici e gli ormoni steroidei: meccanismo di controllo della trascrizione negli eucarioti. L’influenza della struttura della cromatina sulla trascrizione. Come viene modificata l’interazione tra istoni e DNA nella cromatina: l’acetilazione e la deacetilazione. La metilazione degli istoni e del DNA. I rimodellatori della cromatina. Le isole CpG. Eterocromatina ed eucromatina. L’imprinting e l’epigenetica. Gli isolatori.
4. Maturazione e turnover dell’RNA: la maturazione dell’mRNA eucariotico. Splicing, splicing alternativo, editing e stabilità dell’mRNA. La degradazione dell’RNA eucariotico: i pathways di degradazione. Il decapping e la deadenilazione. I P-bodies. I granuli di stress, i granuli di trasporto, i granuli polari, i granuli germinali. Il trasporto dell’ mRNA attraverso i pori nucleari. La degradazione mediata dal non-senso (NMD) e le sue conseguenze sulle patologie umane. L’esosoma: costituzione e funzione.
5. I microRNA e lo short interfering RNA (siRNA). Il ruolo di miRNA e siRNA nel controllo dell’espressione genica. Il complesso RISC. Gli RNA non codificanti (ncRNA). Il progetto ENCODE. L’uso dei tiling arrays.
6. Sintesi proteica. Il codice genetico. Struttura e funzione dei tRNA. Struttura e funzione dei ribosomi. Il meccanismo di sintesi. La regolazione della sintesi proteica. La spesa energetica della sintesi proteica. La stabilità e il turnover delle proteine.
7. Approcci globali nell’analisi dell’espressione genica: la trascrittomica (microarrays) e la proteomica.
8. I meccanismi genetici dello sviluppo embrionale. Strategie di regolazione genica differenziale durante lo sviluppo: la localizzazione dell’mRNA, il contatto cellula-cellula, il gradiente dei morfogeni. Lo sviluppo di Drosophila: la formazione degli assi, i geni gap, pair-rule e omeotici. I geni Hox nei mammiferi. La determinazione del sesso negli insetti e nei vertebrati. L’adesione cellulare nello sviluppo. Le vie principali di segnalazione nello sviluppo.
9. La ricombinazione sito-specifico: i geni delle immunoglobuline e dei recettori dei linfociti T.

Testi consigliati

• L. Allison “Fondamenti di Biologia molecolare” Zanichelli
• B. Alberts et al. “Biologia molecolare della cellula” Zanichelli
• J. Watson et al. “Biologia molecolare del gene” Zanichelli
• T.A. Brown “Genomi” EdiSES
• T.A. Brown 2007 “Biotecnologie molecolari”-Zanichelli, Bologna;
• Glick BR, Pasternak J.J. 2003 Biotecnologia Molecolare, -Zanichelli, Bologna;
• Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook and Russel, CSHL Press;
• Lodish et al., “Biologia molecolare della cellula” Zanichelli
• Twyman R., Old B. Ingegneria Genetica, principi e tecniche, Primrose S., 2004- Zanichelli, Bologna
• Watson J.D., Caudy A.A., Myers R.M., Witkowski J.A., DNA ricombinante, Geni e genomi, 2008- Zanichelli, Bologna
• articoli e riferimenti specifici aggiornati indicati dal docente.

Modalità d'esame

Prova scritta includente anche esercizi e prova orale. Le date di esame sono riportate su Esse3. E’ necessario prenotarsi per le prove di esame. I risultati degli esami saranno riportati, entro una settimana al massimo dalla prova, su Esse3.

Modalità di contatto con i docenti

I docenti sono sempre disponibili a ricevere gli studenti (Dipartimento di Scienze Mediche e Biologiche, Piazzale Kolbe 4, Udine). Per prendere appuntamento telefonare al 0432-494311 (Prof. Gianluca Tell) o inviare email a gianluca.tell@uniud.it. La posta elettronica può essere usata anche per rivolgere direttamente domande o richieste di spiegazione ai docenti.